一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌mlpa检测探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种神经外科手术后颅内细菌性 感染常见致病细菌MLPA检测探针及其应用。
【背景技术】
[0002] 神经外科手术后颅内细菌性感染最常表现为脑膜炎、硬膜下积脓症或脑脓肿。国 外报道颜内感染死亡率为27. 4%~35% [42,43]。国内学者报道，重症神经外科手术后卢页 内细菌性感染死亡率可高达57% [44]。
[0003] 神经外科手术后颅内细菌性感染有几十种致病细菌，常见的有近20种，来自近10 个不同细菌属。大多数为革兰氏阳性菌，其中最常见的病菌是金黄色葡萄球菌和表皮葡萄 球菌（分别可占31%和37% )，其次为链球菌属和疮疱丙酸杆菌（各占近10% )，多为皮 肤性菌群；而革兰氏阴性菌中，肠杆菌属和不动杆菌属为主要病原菌（分别可占近10% )。 此外，绿脓假单胞菌和克雷伯氏肺炎菌是较常见的革兰氏阴性致病菌，该类病菌主要来自 呼吸道和肠道[45]。而国内外有关神经外科手术后颅内细菌性感染的流行病学和微生物学 特征研究结果大致与之类[46]，见表1。
[0004] 以PCR技术为代表的核酸检测技术多年来已经应用到感染的致病微生物诊断。与 传统检测方法相比，核酸检测技术应用诊断神经外科手术后细菌性感染具有很多优势。首 先，核酸检测技术无需细菌的培养分离，只需提取DNA，甚至可直接进行检测，可大大提高 检测速度；其次，核酸检测技术具有非常高的特异性和灵敏度（理论上可检测一个细胞）， 在保证检测准确性的前提下，大大提高了颅内细菌性感染的阳性检出率；再者，核酸检测 技术不仅不受抗生素使用的影响，还可检测致病菌抗生素耐药基因，指导医生用药。常用 的核酸检测技术主要包括焚光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization， FISH)、聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR)、实时定量 PCR(Real_time PCR)、广谱 PCR(Broad range PCR)、多重 Real time PCR、微阵列芯片（Microarray)和测 序（Sequencing)。其中，从检测特异性、敏感性和检测速度等几个方面讲，实时定量PCR仍 然目前是用于脑脊液样本中致病菌检测最为理想的技术。然而，此技术检测通量较低，最多 只能同时检测8种致病菌，漏诊率高。理论上讲，尽管微阵列芯片和测序技术可以实现大多 数致病菌的同时检测，但是这些技术都涉及大量数据的复杂分析，需要具有专业技能的人 员。总之，目前，临床上还没有一次性诊断的神经外科开颅手术后颅内细菌性感染8以上种 致病菌的试剂盒。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种神经外科手术后颅内细菌性感染 常见致病细菌MLPA检测探针及其应用。
[0006] 本发明的具体技术方案如下：
[0007] -种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测探针，包括第一组 探针至第十七组探针，依序为检测脑膜炎奈瑟氏菌、绿脓假单胞菌、沙门氏菌属、嗜麦芽寡 养单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、克雷伯氏肺炎菌、粘质沙雷氏菌、鲁氏不动杆 菌、白喉杆菌、缓症链球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎链球菌、痤疮丙酸杆菌、李斯特氏菌、阴沟肠 杆菌和流感嗜血杆菌的探针，每组探针中分别含有左侧探针LPO和右侧探针RPO :
[0008] 第一组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 1所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 2所不序列；
[0009] 第二组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 3所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 4所不序列；
[0010] 第三组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 5所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 6所示序列；
[0011] 第四组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 7所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 8所不序列；
[0012] 第五组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 9所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 10所不序列；
[0013] 第六组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 11所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 12所不序列；
[0014] 第七组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 13所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 14所不序列；
[0015] 第八组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 15所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 16所示序列；
[0016] 第九组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 17所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 18所不序列；
[0017] 第十组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 19所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 20所不序列；
[0018] 第^^一组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 21所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 22所示序列；
[0019] 第十二组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 23所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 24所示序列；
[0020] 第十三组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 25所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 26所示序列；
[0021] 第十四组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 27所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 28所示序列；
[0022] 第十五组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 29所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 30所示序列；
[0023] 第十六组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 31所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 32所示序列；
[0024] 第十七组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 33所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 34所示序列。
[0025] 在本发明的一个优选实施方案中，所述第一组探针至第十七组探针的每一右侧探 针的5'端连接有如SEQ ID NO 35所示的BsmI酶切位点序列，3'端连接有如SEQ ID NO 36 所示的Ecor V酶切位点序列。
[0026] 一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测方法，采用上述探 针以待检样品的DNA为模板进行杂交。
[0027] 在本发明的一个优选实施方案中，还包括采用一对通用引物对杂交后连接起来的 左侧探针LPO和右侧探针RPO进行PCR扩增，所述通用引物的上游引物和下游引物分别含 有SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38所示的序列。
[0028] -种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测试剂盒，包括上述 探针。
[0029] 在本发明的一个优选实施方案中，还包括一对通用引物，所述通用引物的上游引 物和下游引物分别含有SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38所示的序列。
[0030] 进一步优选的，还包括Ligase_65、Ligase buffer、Probe Mix和PCR Primer Mix， 其中，
[0031] Ligase-65 的配方为：lU/yL，其储存液为 20mM Tris，pH 7.5,50mM KCl，lmM DTT， 0· ImM EDTA 和 50% (v/v)甘油；
[0032] Ligase buffer 的配方为：10XLigation Buffer :400mM Tris，pH 7. 8, IOOmM MgCl2, IOOmM DTT,5mM ATP ；
[0033] Probe Mix的配方为：每个探针的浓度为4fM，工作液为IOmM Tris-Cl, pH 8. 0, ImM EDTA ；
[0034] PCR Primer Mix的配方为：含有所述通用引物的上游引物和下游引物，每个引物 的浓度为10pM，上游引物为Cy 5.0标记，dNTPs 2. 5mM，工作液为IOmM Tris-Cl, pH 8.0， ImM EDTA。
[0035] 本发明的有益效果是：
[0036] 本发明依据MLPA技术研发，能一次、快速诊断神经外科手术后颅内细菌性感染17 种常见致病细菌，为此类病人致病菌的快速诊断提供了可能，有助于降低此类感染的致死 率和致残率。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明实施例5中PrbX的克隆之前PCR扩增反应产物电泳图（以检测1 号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prbl为例，PCR扩增长度为165bp);
[0038] 图2为本发明实施例5中噬菌体颗粒悬液PCR验证的电泳图（以检测1号微生物 脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prbl为例，PCR扩增长度为278bp);
[0039] 图3为本发明实施例5中噬菌体颗粒悬液PCR产物测序验证结果（以检测1号微 生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prbl为例）；
[0040] 图4为本发明实施例6中右侧长探针RPO的制备过程；
[0041] 图5为本发明实施例6中PrbX-M13 ssDNA电泳结果图（以检测1号微生物脑膜 炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prbl为例）；
[0042] 图6为本发明实施例6中PrbX-M13 ssDNA溶液酶切产物电泳分析图（以检测1 号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prbl为例）；
[0043] 图7为本发明实施例7中单靶点PrbX MLPA验证电泳图（以检测1号微生物脑膜 炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prbl为例，MLPA检测到的长度为144bp);
[0044] 图8为本发明实施例7中GeneScan? - 600LIZ Size Standard毛细管电泳图；
[0045] 图9为本发明实施例7中PrbX的MLPA反应毛细管电泳结果（以检测1号微生物 脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prbl为例，MLPA检测到的长度为144bp);
[0046] 图10为本发明实施例8中17个靶点的MLPA反应毛细管电泳结果图；
[0047] 图11为本发明实施例9中利用PrbX(以17号微生物流感嗜血杆菌阳性标准品 质粒为例）检测不同稀释浓度的含Prbl7流感嗜血杆菌靶点DNA的质粒的MLPA检测电泳 图（M，DL 1000DNA Marker ;1-10,分别把检测模板稀释 1，101，102, 103, 104, 105, 106, 107, 108， 109,101°倍，MLPA检测到的长度为512bp);
[0048] 图12为本发明实施例9中（以17号微生物流感嗜血杆菌阳性标准品质粒为例） 模板检测限度重复性实验结果（A，模板IO 8稀释MLPA电泳图；B 10 7倍稀释MLPA反应电泳 检测图；1-20, 20个重复平行实验，MLPA检测到的长度为512bp);
[0049] 图13为本发明实施例9中PrbX探针（以17号微生物流感嗜血杆菌右侧探针 Prbl7为例）不同浓度梯度稀释后MLPA反应凝胶电泳图（M，DL1000DNA Marker ;1-8,探针 做1，101，102, 103, 104, 105, 106, 107, IO8浓度梯度稀释，检测到的长度为512bp);
[0050] 图14为本发明实施例9中PrbX (以17号微生物流感嗜血杆菌右侧探针Prbl7为 例）IO3和10 4浓度梯度稀释20平行重复反应结果（A，10 4稀释重复；B，10 3稀释重复；M，DL 1000DNA Marker ; 1-20, 20个重复平行实验，MLPA检测到的长度为512bp);
[0051] 图15为本发明实施例10中以探针PrbUl号微生物脑膜炎奈瑟氏菌，检测到的长 度分别为144bp)、Prb8(8号微生物粘质沙雷氏菌，检测到的长度分别为271)和Prbl7(17 号微生物流感嗜血杆菌右侧探针Prbl7,检测到的长度分别为512bp)短、中、长三个长度的 探针为例，重复性能检测凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0052] 以下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0053] 实施例1颅内感染致病菌的检测靶点设计
[0054] 首先总结了神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病菌，见表1 :
[0055] 表1.显示神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病菌汇总
[0058] 原则上，颅内感染致病菌的检测靶点的确定流程：进入PubMed查找对每种致病菌 特异性的保守序列，如看家基因16S rRNA、rpoB、gyrB或ITS的序列，如表2所示：
[0059] 表2.神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病菌的检测靶点
[0061] 实施例2 MLPA探针杂交靶点的参考序列
[0062] 通过Blast工具分