反应管，然后依次加入如下表 格试剂充分混匀后做短暂离心。
[0175] Injection mixture 体系：
[0176]
[0177] (3)变性：将反应管中的Injection mixture至于PCR仪80°C恒温变性2min，结 束后立即取出反应管至于冰上数分钟。
[0178] (4)取一个干净的ABI3500上样板，然后将变性好的Injection mixture加入到上 样板的孔槽中，注意加样的时候尽量不要使样品留在管壁，加样结束后做旋转离心使得样 本沉于槽底并保证没有气泡产生。
[0179] (5)使用配套的硅胶垫封闭上样板，然后将上样板放入上样槽中封闭。
[0180] (6)开启ABI3500配套计算机，然后等待机器自检结束后开启ABI3500主机，等待 主机自检结束后（显示灯变成绿色）打开仪器软件。
[0181] (7)开启ABI3500配套软件，检查各种配套的试剂耗材是否已经用完和过期，确 保机器处于可以检测性能时，创建一个模板，做好检测参数（本发明使用P〇p7电泳胶进行 MLPA反应产物分析）、命名和保存位置等设置后然点击运行的样本槽，选择要运行的样本 位置和上样孔的位置。
[0182] (8)打开ABI3500舱门，然后将上样槽放入机器的自动上样手臂，关闭舱门后点击 开启仪器的预热功能，使得仪器个部位的温度达到运行要求，然后点击运行仪器。
[0183] (9)仪器自动运行，结束后产生的数据会自动保存到特定的位置，产生的数据使用 Genmapper分析软件进行分析。
[0184] 毛细管电泳技术是一种分辨率非常高的DNA检测技术，可以明确分辨出差别为 4bp的片段，非常广泛地应用于MLPA反应产物检测。本研究使用ABI3500测序仪对MLPA 反应结果进行毛细管电泳，其中1根毛细电泳管对GeneScan?_600 LIZ Size Standard Marker进行管电泳，发现能够非常精确地定位到每一个每个片段（20bp到600bp大小，橙色 吸收峰，如图8)，并同时逐个对17个诊断探针的单祀点MLPA反应产物进行毛细管电泳，如 图9。证实运用这17对探针对17个阳性质粒标准品的MLPA产物片段长度完全符合设计的 检测长度，单一峰，也证实了每对探针的较好的特异性。
[0185] 实施例8致病细菌阳性标准品17个检测靶点多重MLPA分析
[0186] 1. 17个检测靶点的阳性标准品溶液：17个检测靶点阳性标准品溶液混在一起共 5 μ L0
[0187] 2.多重MLPA探针反应液：取标准单靶点MLPA探针反应液各1 μ L加入到200 μ L 的PCR反应管中，吹打混匀制备成多重反应混合液Mix。
[0188] 3.其他操作步骤与反应体系与条件与实施例7中的3相同。
[0189] 结果如图10。蓝色吸收峰代表多重MLPA反应结果。从该峰值吸收结果判断 Prbl-17均能够反应产生符合设计长度的吸收峰值，说明这17对探针设计是成功的。
[0190] 实施例9 MLPA探针灵敏度验证
[0191] 以检测17号微生物流感嗜血杆菌右侧探针Prbl7的灵敏度检测为例，步骤如下：
[0192] 1.用TE缓冲液把含阳性靶点DNA的质粒做如下梯度稀释：101, 102, 103, 104, 105， 106, 107, 10s，109, IO1?(图 11，泳道 1-10)。探针做如下稀释：1ο1，102, 103, 104, 105, 106, 107， IO8O
[0193] 2.设计模板检测灵敏度要运行的实验：以稀释不同浓度的模板作为反应靶位点， 以1 μπιο?的探针作为反应物MLPA反应，通过1%凝胶电泳分析。
[0194] 3.设计探针灵敏度运行试验：以最长的Prbl7探针为例，做不用浓度的稀释来检 测标准祀序列运行MLPA反应，反应产物用1 %凝胶电泳检测。
[0195] 4.凝胶电泳检测结果后做重复性实验验证最小灵敏度的重复性反应性能。MLPA 产物使用1%凝胶检测。
[0196] 1)检测标准品DNA浓度分析
[0197] 图11凝胶电泳结果显Prbl7探针标准靶点稀释IO7倍（泳道7)能清晰的看到反 应条带，IO 8倍（泳道8)浓度稀释时条带已经接近模糊。然后分别做了两个稀释度的重复 性实验，如图12(Α1-20泳道为稀释IO 8倍，无产物检测到），标准模板做10 7倍（B1-20泳道 为稀释IO7倍，产物被稳定地检测到）稀释后重现性仍然达到100%，说明MLPA探针的检测 灵敏度非常高，可以达到皮克级别的检测限度，和PCR检测灵敏度属于同一级别。
[0198] 2) MLPA探针浓度检测灵敏度分析
[0199] 探针浓度是影响MLPA反应检测限度的重要因素，如图13所示，制备的Prbl7标准 做不同浓度的稀释后进行MLPA反应凝胶电泳图，随着探针的浓度梯度稀释检测结果会有 明显变化，当稀释浓度梯度达到1〇 4(泳道5)稀释后电泳条带完全消失。同时做IO4和10 3 倍浓度梯度稀释的20平行重复实验，稀释IO4倍不能检测到产物（见图14，A 1-20泳道）， 而稀释IO3倍能够稳定地检测到产物（见图14, B 1-20泳道）。说明探针浓度的检测极限 在纳克级别，因此探针的浓度影响着MLPA反应检测，同时也可以控制不同的探针浓度来控 制多重MLPA反应中的探针峰值吸收得到比较好的检测效果。
[0200] 实施例10 MLPA探针重复性验证
[0201] 取标准品作为反应物，以探针PrbUl号微生物脑膜炎奈瑟氏菌，检测到的长度分 别为144bp)、Prb8(8号微生物粘质沙雷氏菌，检测到的长度分别为271)和Prbl7(17号微 生物流感嗜血杆菌右侧探针Prb 17，检测到的长度分别为512bp)短、中、长三个长度的探针 为例，每个探针进行20次MLPA重复实验，再进行1%凝胶电泳检测。如图15所示，短、中、 长三个长度的探针MLPA反应均有明亮单一的条带，初步说明探针重复性能非常好。
[0202] 以上证实此MLPA诊断试剂盒具有较高的探针特异性、敏感性、重复性。另外，经计 算，ImL PrbX-M13噬菌体液体培养液制备的长探针理论上可足够进行16万次的MLPA反应， 使得探针的制备成本大大降低。由此可见，将MLPA技术应用于神经外科颅内细菌性感染的 一次性多致病细菌诊断具有良好的市场开发潜力。
[0203] 实施例11
[0204] 下述序列均为送公司进行化学合成而得
[0205] 一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测试剂盒，包括第一 组探针至第十七组探针，依序为检测脑膜炎奈瑟氏菌、绿脓假单胞菌、沙门氏菌属、嗜麦芽 寡养单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、克雷伯氏肺炎菌、粘质沙雷氏菌、鲁氏不动杆 菌、白喉杆菌、缓症链球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎链球菌、痤疮丙酸杆菌、李斯特氏菌、阴沟肠 杆菌和流感嗜血杆菌的探针，每组探针中分别含有左侧探针LPO和右侧探针RPO :
[0206] 第一组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 1所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 2所不序列；
[0207] 第二组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 3所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 4所不序列；
[0208] 第三组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 5所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 6所示序列；
[0209] 第四组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 7所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 8所不序列；
[0210] 第五组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 9所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 10所不序列；
[0211] 第六组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 11所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 12所不序列；
[0212] 第七组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 13所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 14所不序列；
[0213] 第八组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 15所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 16所示序列；
[0214] 第九组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 17所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 18所不序列；
[0215] 第十组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 19所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 20所不序列；
[0216] 第^^一组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 21所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 22所示序列；
[0217] 第十二组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 23所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 24所示序列；
[0218] 第十三组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 25所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 26所示序列；
[0219] 第十四组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 27所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 28所示序列；
[0220] 第十五组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 29所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 30所示序列；
[0221] 第十六组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 31所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 32所示序列；
[0222] 第十七组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 33所示序列，右侧探针RPO含有 SEQ ID NO 34所示序列。
[0223] 采用上述探针以待检样品的DNA为模板进行杂交。
[0224] 所述第一组探针至第十七组探针的每一右侧探针的5'端连接有如SEQ ID NO 35 所示的BsmI酶切位点序列，3'端连接有如SEQ ID NO 36所示的EcoR V酶切位点序列。
[0225] 该试剂盒还包括采用一对通用引物对杂交后连接起来的左侧探针LPO和右侧探 针RPO进行PCR扩增，所述通用引物的上游引物和下游引物分别含有SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38所亦的序列D
[0226] 进一步的，该试剂盒还包括 Ligase_65、Ligase buffer、Probe Mix 和 PCR Primer Mix，其中，
[0227] Ligase-65 的配方为：1U/uL，其储存液为 20mM Tris，pH 7.5,50mM KCl，lmM DIT， 0· ImM EDTA 和 50% (v/v)甘油；
[0228] Ligase buffer 的配方为：10XLigation Buffer :400mM Tris，pH 7. 8, IOOmM MgCl2, IOOmM DTT?5mM ATP ；
[0229] Probe Mix的配方为：每个探针的浓度为4fM，工作液为IOmM Tris-Cl，pH 8.0, ImM EDTA ；
[0230] PCR Primer Mix的配方为：含有所述通用引物的上游引物和下游引物，每个引物 的浓度为10pM，上游引物为Cy 5.0标记，dNTPs 2.5mM，工作液为IOmM Tris-Cl，pH 8.0， ImM EDTA。
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