析比对神经外科颅内感染17种致病菌的保守性序列之后，确定 参考序列以设计杂交探针，如表3 :
[0063] 表3.显示MLPA探针杂交靶点的参考序列
[0064]
[0065] 实施例3左侧探针LPO
[0066] 本发明所设计的神经外科手术后颅内感染17种致病菌进行MLPA分析的左侧探针 LPO的序列，见表4:
[0067] 表4.左侧探针LPO序列设计结果（为上游通用引物+杂交序列）
[0068]
[0069] 实施例4右侧探针RPO
[0070] 本发明所设计的神经外科颅内感染17种致病菌进行MLPA分析的右侧探针RPO的 序列，见表5 :
[0071] 表5.右侧探针RPO序列设计结果（包括4个部分）
[0074] 实施例5 MLPA右侧探针RPO克隆过程
[0075] 首先设计合成RPO PrbX片段（以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧 探针RPO Prbl (上述表5中1号的Bsm I酶切位点序列+杂交序列+EcoR V酶切 位点序列+下游通用引物序列）制备过程为例），进行PCR(上游引物Primer F : 5' - GCTATGACCATGATTACG-3'（如 SEQ ID NO 57 所示）；下游引物 Primer R : 5' -GGCCAGTGCCAAGCTT-3'（如SEQ ID NO 58所示））扩增、产物纯化、连接克隆至双 链M13mpl8 RF I DNA (NEB公司，N4018S)转化到JM109感受态细胞（Promega公司， L2005)，经过蓝白斑筛选挑取蓝斑进行PCR扩增和测序（上游引物Clo_veri_pimer_ F :5' -TCCGGCTCGTATGTTGTG-3'（如 SEQ ID NO 59 所示）；下游引物 Clo_veri_pimer_R : 5'-CTGCAAGGCGATTAAGTT-3'（如 SEQ ID NO 60 所示））确认。具体步骤如下：
[0076] I. RPO PrbX的PCR扩增反应体系，见表6 :
[0077] 表6. MLPA右侧探针RPO克隆前PCR扩增反应体系
[0078]
[0079]
[0083] 3. PrbX的PCR产物电泳，见图1(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针 RPO
[0084] Prbl制备过程为例，PCR产物为165bp)。
[0085] 4. PCR产物纯化
[0086] 使用 PCR产物纯化试剂盒MiniElute PCR Purification KIT (Qiagen 公司，28〇04) 对定点突变片段的PCR产物进行纯化，最后取10 μ L水进行洗脱（具体步骤参考试剂盒说 明书）。
[0087] 5.连接反应体系，见表8 :
[0088] 表8.右侧探针RPO的DNA连接反应体系
[0091] 6·反应条件：16°C，>8h
[0092] 7.转化实验
[0093] 米用 Single-Use JM109 Competent Cells (Promega 公司，L2005)进行转化实验 (具体步骤参考说明书）。
[0094] 8. PrbX_M13卩策菌体载体验证
[0095] 1)挑取PrbX DNA的连接产物转化成功后得到的单个蓝色噬菌斑，制备噬菌体颗 粒悬液，任取一份进行·菌体颗粒悬液PCR反应验证。
[0096] 2)噬菌体颗粒悬液PCR反应，见表9,10 :
[0097] 表9.噬菌体颗粒悬液PCR反应体系
[0101] 3)电泳验证，见图2。
[0102] 4)测序验证：将噬菌体颗粒悬液PCR产物进行测序，测序结果与标准序列（（以检 测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prbl制备过程为例，，PCR扩增长度为278bp) 进行比对验证，结果如图3。
[0103] 根据噬菌体颗粒悬液PCR产物的电泳验证和测序验证结果，Prbl合成探针DNA 已成功地插入到M13噬菌体载体中。换句话说，Prbl-M13噬菌体载体经验证已构建成功。 该噬菌体载体可用于MLPA右侧探针Prbl的制备。利用相同的方法克隆其它17个探针的 PrbX-Ml3噬菌体载体。
[0104] 实施例6右侧探针RPO PrbX的制备
[0105] 流程包括：提取纯化PrbX-M13噬菌体载体、探针制备引物的设计以及Bsm I和 EcoR V双酶切等内容，见图4(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌的右侧探针RPO Prbl制 备过程为例）。
[0106] 1.右侧探针RPO PrbX的制备
[0107] I) PrbX_M13单链DNA的提取纯化
[0108] (I) PrbX-M13噬菌体液体ImL培养5h，培养体积为lmL。
[0109] (2)将PrbX-M13噬菌体液体培养物离心，得到的上清液用于制备PrbX-M13单链 DNA，细菌沉淀物则用于PrbX-M13双链DNA的制备。
[0110] (3)使用QIAprep Spin M13Kit (Qiagen公司，27704)按照试剂盒说明书进行提取 纯化PrbX-M13单链DNA，最后取100 μ L EB洗脱液洗脱，获得PrbX-M13单链DNA溶液；同 时使用 QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen 公司，27104)试剂盒制备 PrbX_M13 双链 DNA， 以作为参照。
[0111] (4)将提取纯化得到的PrbX-Ml3单链DNA和双链DNA溶液进行电泳分析，电泳结 果如图5 (以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌右侧探针RPO Prbl为例）：
[0112] 2)探针制备引物的设计
[0113] 探针制备引物包括两条，分别与PrbX-M13 ssDNA上EcoR V酶切位点处和Bsm I 酶切位点处退火结合形成双链DNA，然后经过EcoR V和Bsm I限制性内切酶的消化作用便 可得到目的长链探针。探针制备引物的设计主要考虑几个因素包括引物的长度、引物序列 结合位置、引物的Tm值、GC含量等，具体设计结果如表11所示：
[0114] 表1L制备右侧单链探针RPO的引物
[0117] 3)探针制备引物的退火实验
[0118] 此步骤重点在于PrbX_M13 ssDNA的分子量和浓度的计算。探针制备引物的摩尔 数应和含有其他右侧探针RPO PrbX的M13 ssDNA摩尔数大体相等。以检测1号微生物脑 膜炎奈瑟氏菌右侧探针RPO Prbl为例，通过计算可知，Prbl-M13 ssDNA的相对分子量大约 为4.5父106。因此，5001^?41-]\113 880嫩的摩尔数约为10(^111〇1。以5(^1^为终体积， PrbX-M13 ssDNA的终浓度则为2 μΜ。以下是具体实验过程：
[0119] (1)探针制备引物退火反应体系，见表12 :
[0120] 表12.制备探针的引物退火反应体系
[0123] (2)探针制备引物退火反应条件，见表13 :
[0124] 表13.制备探针的引物退火反应条件
[0126] 4) EcoR V 和 Bsm I 酶切实验
[0127] (1)经退火反应之后，向PrbX-M13 ssDNA溶液（43 μ L)中首先加入EcoR V限制性 内切酶进行消化，EcoRV的酶切反应体系见表14 :
[0128] 表14. PrbX_M13 ssDNA溶液EcoR V酶切反应体系
[0130] (2)PrbX-M13 ssDNA 溶液 EcoR V 酶切反应条件：37°C温浴 2h。
[0131] (3)经EcoR V限制性内切酶进行消化后，直接向PrbX-M13 ssDNA溶液（49 μ L)中 Bsm I限制性内切酶进行消化，Bsm I的酶切反应体系见表15 :
[0132] 表15. PrbX_M13 ssDNA溶液Bsm I酶切反应体系
[0134] (4)PrbX-M13 ssDNA 溶液 Bsm I 酶切反应条件：65°C温浴 2h。
[0135] (5) PrbX-M13 ssDNA溶液酶切产物电泳分析，见图6 (以检测1号微生物脑膜炎奈 瑟氏菌右侧探针RPO Prbl为例）。
[0136] 根据电泳结果，Prbl-M13 ssDNA溶液分别经EcoR V和Bsm I限制性内切酶消化 后的产物经电泳分离后得到两个电泳条带，由此可初步判断，prbl-M13 ssDNA溶液酶切 成功，理论上讲，IOObp的位置的条带便是长探针产物，其浓度应为2 μM。该长探针溶液 (PrbX-M13 ssDNA酶切剩余部分不必去除）将作为本课题第一个MLPA右侧探针Prbl用于 下游针对单靶点的MLPA检测验证实验。另外，按照上述既定的实验流程，其他16个探针的 噬菌体载体也同样构建完成，一起用于下游针对多靶点的MLPA检测验证实验。
[0137] 实施例7单靶点MLPA分析
[0138] MLPA右边探针RPO制备完成后，最重要的是要验证其能否和MLPA左侧探针LPO - 起完成对检测靶点的MLPA检测。步骤如下：
[0139] 1.检测单靶点阳性标准品的设计与制备
[0140] 1)针对每一个检测靶点，分别选取包含MLPA探针（LP0+RP0)杂交序列的DNA序列 (长度尽量控制在200-300bp之间），见表16 :
[0141] 表16. 17种致病细菌的阳性标准品检测靶点的DNA序列
[0144] 2)通过基因合成方法合成上述每一个DNA序列，并将合成好的序列克隆入PUC57 质粒载体中（由金斯瑞公司完成）。
[0145] 3)质粒转化大肠杆菌宿主菌中进行扩增培养。
[0146] 4)质粒DNA提取纯化，该质粒DNA即为检测靶点阳性标准品。
[0147] 2. MLPA探针反应液的配制
[0148] I) MLPA LPO和RPO标准溶液制备：
[0149] 分别用 TE (IOmM Tris-HCl, pH 8.0, ImM EDTA)分别将 MLPA LPO(IOOyM)和 RPO 原液（2 μ M，50 μ L)的终浓度稀释到1 μ M。
[0150] 2) MLPA探针反应液制备：
[0151 ] 每一份LPO和RPO标准溶液各取1 μ L混匀，然后加 TE缓冲液到600 μ L，混匀，此 溶液即为MLPA探针反应液（每次取1. 5 μ L进行MLPA反应）。
[0152] 3.单靶点MLPA验证实验
[0153] 1)单检测靶点PrbX阳性标准品溶液准备：
[0154] 用TE悬浮检测靶点阳性标准品（10 μ g)，并稀释至终浓度为IOOng/ μ L，作为储存 液。然后取10 μ L储存液稀释10倍得到单检测靶点阳性标准品溶液（浓度为IOng/ μ L)。
[0155] 2)杂交反应预混液配制（使用前Ih)，见表17 :
[0156] 表17. MLPA杂交反应预混液配制方法
[0158] 3)连接反应预混液配制（使用前Ih)，见表18 :
[0159] 表18. MLPA连接反应预混液配制方法
[0161] 4) PCR反应预混液配制（使用前Ih)，见表19 :
[0162] 表19. PCR反应预混液配制方法
[0164] 5) PCR反应程序设置，见表20 :
[0165] 表20. MLPA杂交PCR反应程序
[0167] 6)DNA变性反应：向200 yL PCR反应管中加入5 yL检测靶点阳性标准品溶液，置 于PCR仪，运行PCR反应St印1和St印2。反应结束后可从PCR仪取下反应管，开始下一步。
[0168] 7)杂交反应：向每个反应管加入3 μ L杂交反应预混液。吹打混勾，运行PCR反应 Step3和Step4。杂交时间>8h。
[0169] 8)连接反应：运行PCR反应Step5。待样本温度为54°C时，每个样本加入32 μ L连 接反应预混液，吹打混匀。继续运行PCR反应Step6-8。
[0170] 9) PCR扩增反应：在室温下，向每个反应管中加入10 μ L PCR反应预混液，轻轻吹 打混匀。然后运行PCR反应Step9-11。
[0171] 10)电泳分析，见图7(以检测1号微生物脑膜炎奈瑟氏菌右侧探针RPO Prbl为 例，检测到的长度为144bp)。
[0172] 11)运行MLPA反应产物检测与特异性分析
[0173] (1)实验准备：检测样本:MLPA反应产物；ABI3500测序仪器相关的试剂与耗材； Liz standard和fornamide保护液至于冰上溶解：Genmapper分析软件。
[0174] (2)上样Injection mixture :取200 μ L的PCR反应管加入1)中的MLPA反应产 物1 μ L和99 μ L的TE缓冲液，然后再取一只200 μ L的PCR