of diphtheria toxin gene, tox, and its regulatory element, dtxR, in Corynebacterium diphtheriae strains causing epidemic diphtheria in Russia and Ukraine. J Clin Microbiol，1996, 34(7):1711-1716
[0265] [34] Pimentaj F. P. , Hirataj R. , Jr. , Rosa, A. C. , et al. A multiplex PCR assay for simultaneous detection of Corynebacterium diphtheriae and differentiation between non-toxigenic and toxigenic isolates. J Med Microbiol，2008,57 (Pt 11):1438-1439
[0266] [35]Kim, ff. , Park, H. K. , Hwang, ff. J. , et al. Simultaneous detection of Streptococcus pneumoniae，S. mitis，and S.oralis by a novel multiplex PCR assay targeting the gyrB gene. J Clin Microbiol, 2013, 51 (3):835-840
[0267] [36] Chen, T. L. ,Siuj L.K. ,Wuj R. C. ,et al. Comparison of one-tube multiplex PCRj automated ribotyping and intergenic spacer (ITS)sequencing for rapid identification of Acinetobacter baumannii.Clin Microbiol Infect，2007, 13(8) :801-806
[0268] [37]Messmer, T. 0. , Whitney, C. G. , Fields, B. S. Use of polymerase chain reaction to identify pneumococcal infection associated with hemorrhage and shock in two previously healthy young children. Clin Chem，1997,43(6 Pt I) :930-935
[0269] [38] Suzuki，N.，Seki，M.，Nakano, Y.，et al. Discrimination of Streptococcus pneumoniae from viridans group streptococci by genomic subtractive hybridization. J Clin Microbiol, 2005, 43(9):4528-4534
[0270] [39] Sfanosj K. S. , Isaacs, ff. B. An evaluation of PCR primer sets used for detection of Propionibacterium acnes in prostate tissue samples. Prostate，2008, 68(14):1492-1495
[0271] [40]Nogva，H. K.，Rudi，K.，Naterstad，K.，et al. Application of 5' -nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures,water, skim milk, and unpasteurized whole milk. Appl Environ Microbi ol，2000, 66(10) :4266-4271
[0272] [41]Eishi，Y.，Suga，M.，Ishige，I.，et al. Quantitative analysis of mycobacterial and propionibacterial DNA in lymph nodes of Japanese and European patients with sarcoidosis. J Clin Microbiol, 2002, 40(I):198-204
[0273] [42]Kanat, A. Risk factors for neurosurgical site infections after craniotomy:a prospective multicenter study of 2944 patients. Neurosurge ry, 1998,43(1) :189-190
[0274] [43] Reichert, M. C. , Medeiros, E. A. , Ferrazj F. A. Hospital-acquired meningitis in patients undergoing craniotomy:incidence, evolution, and risk factors. Am J Infect Control, 2002, 30(3):158-164
[0275] [44]柳国良，罗世祺，王涛.开颅术后神经外科手术后颅内细菌性感染死亡原因 及教训.中华神经外科杂志，1995, 11 (5) :297-299
[0276] [45]Lal Sj McCutcheon IE. Infection after craniotomy. In:Infections in Neurosurgery.American Association of Neurological Surgeons: Park Ridge， 1999, 125-140
[0277] [46]靳桂明，董玉梅，余爱荣.开颅手术后颅内感染流行病学调查的荟萃分析.中 国临床神经外科杂志，2007, 12 (3) : 149-151
[0278] [47]Schouten JPjMcElgunn CJjWaaijer RjZwijnenburg DjDiepvens Fj Pals G. Relative quantification of 40nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res.2002 Jun 15; 30(12) :e57.
[0279] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即 依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
【主权项】
1. 一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测探针，其特征在于：包 括第一组探针至第十七组探针，依序为检测脑膜炎奈瑟氏菌、绿脓假单胞菌、沙门氏菌属、 嗜麦芽寡养单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、克雷伯氏肺炎菌、粘质沙雷氏菌、鲁氏 不动杆菌、白喉杆菌、缓症链球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎链球菌、痤疮丙酸杆菌、李斯特氏菌、 阴沟肠杆菌和流感嗜血杆菌的探针，每组探针中分别含有左侧探针LPO和右侧探针RPO : 第一组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 1所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 2所示序列； 第二组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 3所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 4所示序列； 第三组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 5所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 6所示序列； 第四组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 7所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 8所示序列； 第五组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 9所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 10所示序列； 第六组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 11所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 12所不序列； 第七组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 13所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 14所不序列； 第八组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 15所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 16所示序列； 第九组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 17所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 18所不序列； 第十组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 19所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 20所不序列； 第十一组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 21所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 22所不序列； 第十二组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 23所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 24所不序列； 第十三组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 25所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 26所示序列； 第十四组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 27所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 28所不序列； 第十五组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 29所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 30所不序列； 第十六组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 31所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 32所不序列； 第十七组探针的左侧探针LPO含有SEQ ID NO 33所示序列，右侧探针RPO含有SEQ ID NO 34所示序列。2. 如权利要求1所述的一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测 探针，其特征在于：所述第一组探针至第十七组探针的每一右侧探针的5'端连接有如SEQ ID NO 35所示的BsmI酶切位点序列，3'端连接有如SEQ ID NO 36所示的EcoR V酶切位 点序列。3. -种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测方法，其特征在于：采 用权利要求1或2所述的探针以待检样品的DNA为模板进行杂交。4. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：还包括采用一对通用引物对杂交后连 接起来的左侧探针LPO和右侧探针RPO进行PCR扩增，所述通用引物的上游引物和下游引 物分别含有SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38所示的序列。5. -种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测试剂盒，其特征在于： 包括权利要求1或2所述的探针。6. 如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于：还包括一对通用引物，所述通用引物 的上游引物和下游引物分别含有SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38所示的序列。7. 如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于：还包括Ligase-65、Ligase buffer、 Probe Mix 和 PCR Primer Mix，其中， Ligase-65 的配方为：lU/yL，其储存液为 20mM Tris，pH 7.5,50mM KCl，lmM DTT， 0? ImM EDTA 和 50% (v/v)甘油； Ligase buffer 的配方为：10XLigation Buffer :400mM Tris，pH 7. 8, IOOmM MgCl2， IOOmM DTT,5mM ATP ； Probe Mix的配方为：每个探针的浓度为4fM，工作液为IOmM Tris-Cl, pH 8.0, ImM EDTA ； PCR Primer Mix的配方为：含有所述通用引物的上游引物和下游引物，每个引物的浓 度为 10pM，上游引物为 Cy 5.0 标记，dNTPs 2.5mM，工作液为 IOmM Tris-Cl，pH 8.0，lmM EDTA。
【专利摘要】本发明公开了一种神经外科手术后颅内细菌性感染常见致病细菌MLPA检测探针及其应用，该探针包括第一组探针至第十七组探针，依序为检测脑膜炎奈瑟氏菌、绿脓假单胞菌、沙门氏菌属、嗜麦芽寡养单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、克雷伯氏肺炎菌、粘质沙雷氏菌、鲁氏不动杆菌、白喉杆菌、缓症链球菌、鲍氏不动杆菌、肺炎链球菌、痤疮丙酸杆菌、李斯特氏菌、阴沟肠杆菌和流感嗜血杆菌的探针。本发明依据MLPA技术研发，能一次、快速诊断神经外科手术后颅内细菌性感染17种常见致病细菌，为此类病人致病菌的快速诊断提供了可能，有助于降低此类感染的致死率和致残率。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/14
【公开号】CN105018601
【申请号】CN201510361873
【发明人】王明席, 李云振, 王庆波, 姜涛
【申请人】华侨大学, 厦门柏嘉生物科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年6月26日