InDel标记的检测引物及其在桔红心大白菜育种中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大白菜InDel标记及其引物与应用，特别涉及InDel标记的检测引物 及其在桔红心大白菜育种中的应用，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 利用传统育种方法进行品种选育存在育种时间长、速度慢的缺点。并且，有时候由 于表型不明显而使得表型鉴定难以进行。随着分子生物学的发展，为传统育种学注入了新 的活力。特别是分子标记的出现使得育种工作中的选择由传统的表型选择转变为基因型 选择，大大提高了选择的准确性和效率。基于PCR的分子标记如RAPD(random amplified polymorphic DNA)、SSR(Simple sequence repeat)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、InDel (insertion-deletion)等的出现，因其简便、快速和高效等特点，使 分子标记的开发与利用已遍及各种作物。其中InDel标记是由于同一位点处的DNA序列在 不同个体间发生了核苷酸片段的插入/缺失，根据目标位点两侧的序列设计特异引物进行 PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDel标记。由于InDel标记为共显性标记，具有较 好的稳定性及多态性丰富等优点已被广泛应用于多态性分析、基因的精细定位及图位克隆 等。
[0003] 大白菜（Brassica rapa ssp. pekinensis，AA 基因组，2n = 20)起源于中国，是我 国分布最广、种植面积最大的蔬菜作物，素有"国菜"之称。大白菜心叶颜色通常有白色、黄 色和桔红色。其中桔红色是利用生物技术手段将大白菜与芜菁杂交而得到的一个新的种 质资源。研究表明：桔红心大白菜的维生素 C、类胡萝卜素及矿质元素含量均高于普通大白 菜，并且含有普通大白菜中没有的番茄红素，营养价值远高于普通大白菜。但到目前为止， 由于与桔红心性状紧密连锁标记的缺乏，桔红心大白菜品种的选育仍主要依靠传统育种方 法，严重阻碍了其育种的进程。因此，开发与大白菜桔红心性状紧密连锁的分子标记，对于 快速培育桔红心大白菜新品种将有重要的指导及实践意义。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供一种与大白菜桔红心性状紧密连锁的InDel标 记的检测引物及其在桔红心大白菜育种中的应用。
[0005] 本发明技术方案如下：
[0006] 大白菜InDel标记0R-1的检测引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0007] 上述大白菜InDel标记0R-1的检测引物在桔红心大白菜品种选育中的应用。
[0008] 根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：
[0009] (1)提取待检测大白菜品种的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
[0010] ⑵以步骤⑴制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA进行PCR扩 增，制得PCR扩增产物；
[0011] (3)将步骤（2)制得的PCR扩增产物经凝胶电泳后，当PCR产物电泳图谱显示被测 样品仅有207bp -条条带时，则该被检测样品为黄心纯合材料；当PCR产物电泳图谱显示仅 有232bp -条条带时，则该被检测样品为桔红心纯合材料；当PCR产物电泳图谱显示同时含 有207bp和232bp条带时，则该被检测样品为黄心和桔红心杂合材料，表型上为黄心材料。
[0012] 根据本发明进一步优选的，所述步骤（1)中，提取待检测大白菜品种的基因组DNA 采用改良的CTAB法提取。
[0013] 根据本发明进一步优选的，所述步骤（2)中，20 yL的PCR反应体系如下：
[0014] 20ng/yL 模板 DNA 2yL，含 20mM 1%(：12的 10XPCR buffer 2yL，2.5mM dNTPs 0· 5 μ L，10 μ M上游引物(λ 4 μ L，10 μ M 下游引物(λ 4 μ L，IU TaqDNA 聚合酶(λ 2 μ L，加 ddH20 至 20 μ L。
[0015] 根据本发明进一步优选的，所述步骤（2)中，PCR扩增程序为：
[0016] 95°(：预变性5!1^11;94°(：变性3〇8,60°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8，共计36个循环 ； 72°C延伸 IOmin。
[0017] 根据本发明进一步优选的，所述步骤（3)中，凝胶电泳为质量百分比为8%的变性 聚丙烯酰氨凝胶电泳。
[0018] 有益效果
[0019] 本发明首次公开了大白菜InDel标记OR-I及其引物，通过对黄心和桔红心大白菜 自交系以及二者杂交后产生的F2代分离群体材料的DNA进行PCR扩增，并利用8%变性聚 丙烯酰氨凝胶电泳进行检测，发现OR-I标记引物的扩增产物可明显区分黄心和桔红心大 白菜，可用于桔红心大白菜新品种的选育。
【附图说明】
[0020] 图1是大白菜InDel标记OR-I的核苷酸序列。图中划线标识区域为Indel标记 OR-I ;桔红心大白菜（14-490)与黄心大白菜（14-401)相比，有25bp的DNA插入；
[0021] 图2是大白菜InDel标记OR-I的引物在黄心（14-401)和桔红心（14-490)大白 菜以及二者杂交后产生的F2代分离群体材料中的PCR扩增电泳图；
[0022] 图中：泳道I :14-490(桔红心），泳道2 :14-401(黄心），泳道3-13 :14-490和 14-401杂交F2代黄心群体，泳道14-21 :14-490和14-401杂交F2代桔红心群体；
[0023] 图3是大白菜InDel标记OR-I的引物在市场上销售的桔红心、黄心大白菜品种以 及其它桔红心、黄心大白菜材料中的PCR扩增电泳图；
[0024] 图中：泳道 1-11 (黄心）：分别是 663、1466、1469、1492、1505、1510、1720、寒秀、 金典春王、凯春、日本夏阳，泳道12-23(桔红心）：分别是1480、14-102、14-245、14-253、 14-257、14-277、14-426、14-662、14-669、长研桔宝、申萌桔红心、神师桔红心。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保 护范围不限于此。
[0026] 生物材料来源
[0027] 大白菜 14-401、14-490、663、1466、1469、1492、1505、1510、1720、1480 以及 14-401 和14-490的杂交F2代购自山东鲁蔬种业有限责任公司；
[0028] 大白菜 14-102、14-245、14-253、14-257、14-277、14-426、14-662、14-669 购自山 东登海种业股份有限公司西由种子分公司；
[0029] 大白菜品种寒秀和金典春王购自福州立信种苗有限公司，凯春购自韩国SAKATA 公司，日本夏阳购自福州闽皇种业有限公司，长研桔宝购自济南元能生物科技有限公司，申 萌桔红心购自山东齐鲁种业有限公司，神师桔红心购自山东青州市新世纪种苗有限公司。
[0030] 实施例1. InDel标记引物的开发
[0031] 以类胡萝卜素合成相关基因为候选基因，利用重测序技术对黄心（14-401)和桔 红心（14-490)大白菜进行全基因组重测序。根据重测序结果对黄心和桔红心大白菜中的 候选基因进行序列比对，对其中的1个InDel标记OR-I设计引物，该大白菜InDel标记OR-I 的序列比对图如图1所示。图中划线标识区域为Indel标记0R-1。桔红心大白菜（14-490) 与黄心大白菜（14-401)相比，有25bp的DNA插入。获得大白菜InDel标记OR-I的检测引