一种超滤处理黄霉素发酵液的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工技术领域，涉及一种超滤处理黄霉素发酵液的方法。
【背景技术】
[0002] 黄霉素，又名默诺霉素（moenomycin)，是一种磷酸糖脂类抗生素，为斑伯氏链霉菌 的发酵产物，是一些结构类似物的通用名称。黄霉素对革兰氏阳性菌作用较强，其药理作用 在于干扰肽聚糖的生物合成，导致细菌细胞破裂而引起细菌自溶。长期以来，黄霉素主要作 为抗生素类畜禽生长促进剂在世界各国使用。中国专利CN1194984A公开了黄霉素的新用 途，黄霉素及其铋盐组合物可以控制幽门螺杆菌的感染，治疗胃溃疡等各种胃病。为了减少 药物的副作用，人用药物其药用组分一般为单一的化合物，因此黄霉素A组分的分离纯化 研究价值凸显。
[0003] 英国专利GB1068639与中国专利ZL200510051382. 1通过对溶剂萃取、透析、沉 淀、硅酸镁柱层析脱色、凝胶过滤柱层析、阴离子交换色谱、反相色谱等分离纯化方法的不 同组合，去除了其它杂质，得到了黄霉素各组分的混合物。
[0004] 有关单一黄霉素A组分的分离纯化文献如下所述：
[0005] 美国专利US3660569在对料液前处理的基础上，通过硅胶正相色谱得到黄霉素A 组分。
[0006] 孙承航等人（磷酸糖脂类抗生素moenomycinA的分离和鉴定，中国抗生素杂志， 2003, 28(6) :325-327, 360)先以美国专利US3660569公开的正相色谱预分离黄霉素，再通 过分析级反相色谱柱，得到了黄霉素A组分纯品。
[0007] 中国专利ZL201210029457. 6公开了一种制备黄霉素A组分的方法。通过C18固 相萃取一C18分析柱分离一C18固相萃取进一步精制，为了保证纯度，所用试剂均为色谱纯 及超纯水，最后得到淡黄色的MonA。
[0008] 美国专利US5986089所公开的黄霉素A组分的制备工艺其核心工艺为大孔吸附 或超滤与溶剂萃取组合一阴离子交换色谱一反相色谱。
[0009] 综上所述，由于黄霉素各组分之间结构的类似性，为了得到单一的黄霉素A组分， 上述专利均以不同模式的色谱分离为核心。为了达到色谱分离的目的，同时也为了保护昂 贵的色谱填料，在色谱分离前都有多步预处理工艺，工艺冗长繁琐，成本极高。
[0010] 德国Hoechst公司申报了一系列关于黄霉素分离纯化的专利，如英国专利GB 1068639、美国专利US3660569、US3674866等都提及黄霉素具有不可透析的特性，也就是 说黄霉素作为一种分子量68000-70000的大分子化合物，不能透过常规的膜孔。并以此特 性为基础分离、纯化黄霉素。如英国专利GB1068639提出透析法分离黄霉素有特别的优 势，并在实施实例中将溶剂萃取后的黄霉素连续透析3天。作为透析原理的现代工业应用， 美国专利US5986089也在实施例中详解了超滤法分离纯化黄霉素的过程，但以实施例中 的数据来分析，超滤法的实际效果逊于大孔吸附法。
[0011] 后来的研究表明黄霉素各组分的分子量远远小于早期的认识，真实的分子量小于 1600。黄霉素之所以不能透析以及早期对其分子量的错误认识在于黄霉素独特的化学结 构。黄霉素为两性化合物，其一端为疏水性极强的C25脂肪链，另一端含有5个亲水性极强 的单糖，以及可电离的3个酸性位点，因此其物理化学性质与离子型表面活性剂类似。在 水溶液中黄霉素分子相互聚集，以胶束的形式存在，因而表现出大分子的特征，比如难以透 析。也正是基于此特性，英国专利GB1068639、美国专利US5986089通过膜分离的方式分 离黄霉素，即小分子杂质透过膜孔，而将黄霉素以大分子胶束的形式滞留在膜的另一侧。
【发明内容】
[0012] 为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种超滤处理黄霉素发酵 液的方法，该方法操作流程简单，节能环保，
[0013] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0014] 本发明公开了一种超滤处理黄霉素发酵液的方法，包括以下步骤：
[0015] 1)将黄霉素发酵液用去离子水连续超滤lh，弃去透析液；
[0016] 2)将步骤1)超滤截留的黄霉素发酵液用含有胶束调节剂的水溶液继续超滤lh， 收集富集黄霉素的透析液。
[0017] 步骤2)所述的胶束调节剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、甲酰胺或尿素。
[0018] 超滤所用超滤膜的材质为聚醚砜、聚砜、聚丙烯腈或聚酰胺。
[0019] 超滤所用超滤膜的截留分子量为3000~50000。
[0020] 在步骤1)前还包括对黄霉素发酵液进行预处理，具体操作为：将黄霉素发酵液于 4°C冷藏过夜，然后在8000r/min的条件下离心lOmin。
[0021] 在步骤2)后还包括对富集黄霉素的透析液采用色谱法进行精制的步骤。
[0022] 精制采用正相色谱法、反相色谱法或离子交换色谱法。
[0023] 正相色谱的填料为硅胶，其粒径为20~150ym;离子交换色谱填料的骨架为聚甲 基丙烯酸酯类，其功能基团为-CH2-CH2-NH-(C2H5)2，粒径为20~75ym。
[0024] 反相色谱法具体操作为：
[0025] 将富集黄霉素的透析液的pH值调节至3. 0~4. 5,以50~250cm/hr的流速栗入 装填有反相色谱填料的层析柱，以相同的流速，选取pH值为8. 30的20 %甲醇溶液为A流动 相，以纯甲醇为B流动相，按照0~40%B流动相线性梯度洗脱40min，再用40%B流动相 等梯度洗脱至黄霉素A组分完全解吸，合并高纯度黄霉素A组分，去除溶剂后冷冻干燥，得 到精制后的黄霉素A组分产品。
[0026] 所用的反相色谱填料孔径为l〇〇A~300A,粒径为20~75ym;反相色谱填料为 硅胶改性的C8、C18填料，或者为聚合物基质的色谱填料；
[0027] 聚合物基质为苯乙烯-二乙烯苯聚合物或聚甲基丙烯酸酯类聚合物。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0029] 本发明公开的一种超滤处理黄霉素发酵液的方法，首先将黄霉素发酵液用去离子 水连续超滤，除去发酵液中的小分子杂质，黄霉素截留在膜的另一侧；再通过添加含有能 够调节胶束大小的调节剂水溶液继续超滤，黄霉素胶束被破坏或胶束变小从而透过膜而一 些大分子杂质被膜所截留，从而得到超滤处理过的富集黄霉素的超滤液。本发明采用的超 滤法与现有工艺相比，工艺简单，操作流程大为缩短，耗能低，绿色环保，适合工业化规模生 产。
[0030] 进一步地，本发明对富集黄霉素的超滤液采用制备色谱进行精制，得到黄霉素A 组分。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0032] 本发明所采取的技术方案如下：
[0033] 一种超滤处理黄霉素发酵液的方法，包括以下步骤：
[0034] (1)超滤法预分离黄霉素
[0035] 将黄霉素发酵滤液放于冰箱冷藏室过夜，8000r/min条件下离心lOmin，去除沉淀 物，得到黄霉素离心上清液；
[0036] 超滤分为两步，第一，将黄霉素离心上清液用去离子水连续超滤lh，除去过滤液中 的小分子杂质，黄霉素截留在膜的另一侧；第二，添加含有胶束大小调节剂的水溶液继续超 滤，黄霉素胶束被破坏或胶束变小从而透过膜而一些大分子杂质被膜所截留。
[0037] 所述的胶束调节剂包括C1-C3的低级醇如甲醇、乙醇和异丙醇、乙二醇、酰胺类如 甲酰胺、尿素；
[0038] 超滤所用的超滤膜的材质为聚醚砜、聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺；
[0039] 超滤所用的超滤膜的截留分子量为3000-50000 ;
[0040] (2)色谱法精制
[0041] 可以采用正相色谱、反相色谱及离子交换色谱。
[0042] 以下为反相色谱法：
[0043] 取160~400mL超滤法所得富含黄霉素溶液，调节pH= 3. 0~4. 5,以50-250cm/ hr流速栗入装填有反相色谱填料的层析柱（20X250mm)。接着以同样流速，用pH= 8. 30 的20 %甲醇作为A流动相，100 %甲醇为B流动相，按照0-40 %B线性梯度方式洗脱40min， 再用40%B等梯度方式洗脱至MonA组分完全解吸，合并高纯度MonA馏分。经超滤或旋 蒸去溶剂，冷冻干燥得到产品。
[0044] 所述的反相色谱其填料粒径20-75ym，反相色谱调料包括硅胶改性的C8或C18填 料以及聚合物基质的反相填料，所述的聚合物基质包括苯乙烯一二乙烯苯聚合物或聚甲基 丙烯酸酯类聚合物；
[0045] 所述的正相色谱其填料粒径20-150ym;
[0046] 所述的离子交换色谱其填料粒径20-75ym，为聚甲基丙烯酸酯类骨架、功能基团 为-ch2-ch2-nh-(c2h5)2〇
[0047]1、黄霉素A在不同添加剂下的截留
[0048] 将黄霉素发酵液（固含量为30g/L)放于冰箱冷藏室（4°C)过夜，8000r/min条件 下离心lOmin，去除沉淀物，上清液备用。
[0049] 各取30mL离心上清液，分别添加甲醇、乙醇、异丙醇5mL，乙二醇lmL、甲酰胺lmL、 尿素lg。将上述上清液用MinimateTangentialFlowFiltrationSystem(美国Pall公 司）超滤，超滤膜为截留分子量l〇K的聚醚砜超滤膜，操作压力25psi，对浓缩液进行HPLC 检测，结果见表1。
[0050] 表1黄霉素A在不同添加剂下的截留
[0051]
[0052] 可见，添加甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、甲酰胺、尿素溶液后，有部分黄霉素A组 分可透过膜孔，导致其膜的截留率下降。原因是这些物质提高了黄霉素的临界胶束浓度 (CMC,criticalmicelleconce