一种暗褐网柄牛肝菌担孢子萌发的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种暗褐网柄牛肝菌担孢子萌发的方法，属食用菌育种技术领域。
【背景技术】
[0002]暗褐网柄牛肝菌，Phlebopusportentosus (Berk & Broome) Boedi jn，隶属于牛肝菌目小牛肝菌科(Boletinellaceae)，主要分布于泛热带地区，包括国内的云南、四川、广西、海南等地，国外的泰国、斯里兰卡、越南、印度尼西亚、澳大利亚、新西兰、非洲、墨西哥等地。暗褐网柄牛肝菌俗名“黑牛肝菌”，其味道鲜美，营养丰富，是云南南部及泰国北部最受欢迎的野生食用菌之一，并且是目前已知的唯一能够真正实现人工菇房栽培的可食用牛肝菌。在脱离宿主树接种于人工培养基的情况下，暗褐网柄牛肝菌担孢子、菌丝体在实验室条件下能够萌发、生长、交配，在菇房中经过约3个月时间的培养，能够完成整个生活史，形成子实体。近年来，有关该牛肝菌温室栽培、田间栽培方面的相关研究不断涌现，这些研究为该牛肝菌的产业化、规模化生产奠定了坚实的基础，其商业化推广栽培已见雏形。另一方面，暗褐网柄牛肝菌能够实现在较短的周期内，在人工温室的条件下完成有性世代的循环，这对于研究其生活史过程中的各种环境因素，获得足够多的子代进行遗传学研究，以及进行基因功能的验证都是十分有利的条件，因此可以把它当作牛肝菌目的模式生物之一来研究。
[0003]由孢子萌发获得的单孢菌株作为担子菌生活史中的单倍体阶段，在杂交育种、担子菌遗传学研究中都有及其重要的作用。杂交育种技术是食用菌新品种选育中使用最为广泛，收效最显著的育种手段，其原理是通过单倍体交配实现基因重组，从杂交后代中选育兼具双亲优良性状的菌株。在常规栽培的食用菌中，优良品种的80%以上都是来源于单孢杂交育种。另外，在进行担子菌遗传图谱绘制，数量性状基因定位，基因转化等遗传学研究时，单孢菌丝也是非常理想的材料。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种暗褐网柄牛肝菌担孢子萌发的方法。
[0005]本发明方法通过改良预处理方法及孢子萌发培养基，仅需9-11天其担孢子即开始萌发，大大缩短了孢子萌发所需时间，为将来暗褐网柄牛肝菌的杂交育种、遗传学研究奠定了良好的基础，应用前景广泛。
[0006]本发明的暗褐网柄牛肝菌担孢子萌发方法，包括以下步骤:
(1)担孢子收集:选择人工菇房中菌孔刚刚开始开放的暗褐网柄牛肝菌子实体，用预先灭菌的试管，在无菌条件下选下部分菌盖，使其粘于试管口处，将试管置于无菌环境中静置过夜，使担孢子自然弹射到试管底部，24小时后，肉眼见试管壁上及底部出现褐色担孢子印时取出子实体块，用酒精灯火焰对试管口进行灭菌处理，塞回棉塞，完成担孢子收集；
(2)孢子悬浮液预处理:在上述含有暗褐网柄牛肝菌担孢子的试管中加入1ml无菌水，制成孢子悬浮液，置于45°C培养箱中培养48小时，对孢子悬浮液进行预处理；
(3)孢子萌发培养:在无菌条件下以无菌水对预处理过的孢子悬浮液进行稀释，至100倍显微镜视野中有10~20个担孢子时，将其涂布于暗褐网柄牛肝菌担孢子萌发培养基，置于28°C培养，9-11天担孢子萌发；
暗褐网柄牛肝菌担孢子萌发培养基配方及制作方法为:称取200克红土壤，200克去皮马铃薯，加水煮沸30分钟后，纱布过滤，加入葡萄糖20克，KH2PO4 I克，MgSO2 I克，酵母膏浸提液2克，琼脂粉20克，加水定容至1000 ml，pH值自然，121°C灭菌30分钟，待其冷却至60°C以下但未凝固时，加入青霉素和链霉素，使其终浓度为100U/ml，混匀后立即倒平板备用。
[0007]本发明的有益效果在于:通过改良暗褐网柄牛肝菌预处理方法及孢子萌发培养基，大大缩短了孢子萌发所需时间，仅需9-11天其担孢子即开始萌发，提高了孢子萌发培养效率，为将来暗褐网柄牛肝菌的杂交育种、遗传学研究奠定了良好的基础，应用前景广泛。
具体实施例
[0008]本发明用担孢子萌发方法对暗褐网柄牛肝菌担孢子进行萌发，具体步骤如下:
(I)担孢子收集:选择人工菇房中菌孔刚刚开始开放的暗褐网柄牛肝菌子实体，利用预先灭菌的试管，在无菌条件下选下部分菌盖，使其粘于试管口处，将试管置于无菌环境中静置过夜，使担孢子自然弹射到试管底部，24小时后，肉眼可见试管壁上及底部出现褐色担孢子印，取出子实体块，利用酒精灯火焰对试管口进行灭菌处理，塞回棉塞，完成担孢子收集。
[0009](2)孢子悬浮液预处理:在上述含有暗褐网柄牛肝菌担孢子的试管中加入1ml无菌水，制成孢子悬浮液，置于45°C培养箱中培养48小时，对孢子悬浮液进行预处理；
(3)孢子萌发培养:在无菌条件下将预处理过的孢子悬浮液稀释至100倍显微镜视野中有10~20个担孢子，将其涂布于暗褐网柄牛肝菌担孢子萌发培养基，置于28°C培养，9天~11天担孢子萌发。
[0010]暗褐网柄牛肝菌担孢子萌发培养基配方及制作方法为:称取200克红土壤，200克去皮马铃薯，加水煮沸30分钟后，纱布过滤，加入葡萄糖20克，KH2PO4 I克，MgSO2 I克，酵母膏浸提液2克，琼脂粉20克，加水定容至1000 ml，pH值自然，121°C灭菌30分钟，待其冷却至60°C以下，但未凝固时，加入青霉素和链霉素，使其终浓度为100U/ml，混匀后立即倒平板备用。
[0011 ] 实际应用表明:本发明方法孢子萌发培养仅需9天-1I天，而普通PDA培养基孢子萌发培养则需29天-31天，本发明方法大大缩短了孢子萌发所需时间，提高了孢子萌发培养效率。
【主权项】
1.一种暗褐网柄牛肝菌担孢子萌发的方法，包括担孢子收集，孢子悬浮液预处理，及孢子萌发培养步骤；其特征在于: a.孢子悬浮液预处理步骤中:制成的孢子悬浮液，置于45°C培养箱中培养48小时，对孢子悬浮液进行预处理； b.孢子萌发培养基为:称取200克红土壤，200克去皮马铃薯，加水煮沸30分钟后，纱布过滤，加入葡萄糖20克，KH2PO4 I克，MgSO2 I克，酵母膏浸提液2克，琼脂粉20克，加水定容至1000 ml，pH值自然，121 °C灭菌30分钟，待其冷却至60°C以下，未凝固时，加入青霉素和链霉素，使其终浓度为100U/ml，混匀后立即倒平板备用。
【专利摘要】本发明涉及一种暗褐网柄牛肝菌担孢子萌发的方法，属食用菌育种技术领域。本发明方法的征在于：a.制成的孢子悬浮液，置于45℃培养箱中培养48小时，对孢子悬浮液进行预处理；b.孢子萌发培养基为：称取200克红土壤，200克去皮马铃薯，加水煮沸30分钟后，纱布过滤，加入葡萄糖20克，KH2PO4？1克，MgSO2？1克，酵母膏浸提液2克，琼脂粉20克，加水定容至1000ml，pH值自然，121℃灭菌30分钟，待其冷却至60℃以下，未凝固时，加入青霉素和链霉素，使其终浓度为100U/ml，混匀后立即倒平板备用。本发明的有益效果在于：大大缩短了孢子萌发所需时间，仅需9-11天其担孢子即开始萌发，为将来暗褐网柄牛肝菌的杂交育种、遗传学研究奠定了良好的基础，应用前景广泛。
【IPC分类】C12N1/14, C12R1/645
【公开号】CN105039178
【申请号】CN201510495116
【发明人】曹旸, 张春霞, 何明霞, 刘静, 高锋, 王文兵, 许欣景, 徐建平, 张颖
【申请人】云南省热带作物科学研究所
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月13日