一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法，属于水 稻遗传改良与农业生物技术应用领域。
【背景技术】
[0002] 特种稻是具有特殊遗传性状和特殊用途的水稻，近年来成为研究开发的热点。特 种稻香型红米品种，有补血、滋阴、开胃和中等功效，素称米中珍品，古代是地方官呈贡皇 家的贡米。李时珍《本草纲目》记载："糯稻，……其性粘，可以酿酒，可以为粢，可以蒸糕， 可以熬饧，可以炒食。其类亦多，其谷壳有红、白二色，或有毛，或无毛。其米亦有赤、白二色， 赤者酒多糟少"；"赤者粒大而香，水浸之有味；益人温中，益气补下元也；平和五脏，补益血 气，其功不莫述"，赤米即红米。现代科研证明，红米、黑米等有色米含有大量人体所需要的 营养兀素，丰富的蛋白质，氣基酸等，每千克含氣基酸8. 4%、蛋白质8. 17%、含f丐137. 56mg、 铁79. 74mg、锌18. 48mg、还含有硒、黄酮、色素和多种维生素，具有颇高的营养保健价值。能 清除自由基、延缓衰老；改善营养性贫血；增强免疫力；具有降血脂、抗动脉粥样硬化功能； 具有耐氧化、抗疲劳等应激功能；镇定和改善睡眠，加强神经中枢的抑制，对睡眠较差的老 年人有催眠效果等，是少年和老年人食用的滋补佳品，也是食品加工、酿造和提取色素的优 质原料，特别是红米有着特殊的营养保健功能，具有升高血浆高密度脂肪胆固醇，提高机体 抗氧化能力的作用，很适宜于老年人补钙和儿童强筋壮骨。
[0003] 目前，对水稻种皮红色素已有广泛的研究，结果表明红米的形成由于原花色素在 种皮中沉积而形成，属于类黄酮物质，由Rc基因调控。Rc基因被定位于第7号染色体上， 在白米种皮水稻材料中，该基因第6个外显子有14bp的碱基缺失，从而导致了该基因的 功能丧失。红米对于白米为显性，从形态上淘汰白米植株需要多代，并因稻米成熟后才呈现 红色，而育种则需要在抽穗时选株杂交或回交，所以难于当代选株育种。
[0004] 香型水稻具有独特的香味且口感好，营养价值较高，其销售价格往往比普通大米 要高出许多。控制香味的基因fgr位于8号染色体上，在第7个外显子中出现了一个8 bp 的缺失和3 bp的变异，结果导致翻译提前终止，产生无功能的截短蛋白。
[0005] 在香米育种中，十分关键的问题是对香味性状的准确鉴定，育种家常采用感官鉴 定或用1. 7%氢氧化钾鉴定的方法以提高香米选择的效率，然而这些方法在对大的群体进 行选择时具有一定的局限性。
[0006] 选育红米与香味相结合的优质高产品种，是特种稻主要育种目标之一。红米基因 Rc与香味基因fgr位于不同染色体，有利于分子标记辅助选择进行组合育种。
[0007] 中国发明"一种鉴定水稻香味的方法及香味性状共分离的分子标记"，申请号 200810015264. 9公开了一种鉴定水稻香味的方法，但还是通过嗅觉来进行的，有一定的局 限性，鉴定不准。为实现对水稻香味基因fgr和红米基因Rc的快速鉴定，采用分子标记进 行新品种选育将会是一项非常有实用价值的发明。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方 法，以实现对水稻香味基因fgr和红米基因Rc的快速鉴定。水稻育种中，将香味和红米结 合选育优质特用稻，根据香味基因fgr对香与非香的差异和红米基因Rc对红米与白米的 差异，开展了分子标记引物的改良、PCR反应体系的优化，建立了能同时检测水稻香味基因 fgr和红米基因Rc的多重PCR方法，构建了水稻香味基因fgr和红米基因Rc分子标记的 多重PCR反应体系。
[0009] 为实现上述发明的目的，本发明采用的技术方案如下： 一种检测水稻香味基因fgr和红米基因Rc的多重PCR方法： 利用PCR反应体系中，同时加入香味基因fgr和红米基因Rc的两对特异引物，并对 dNTPs浓度及引物浓度进行优化，在55. 5°C的退火温度，扩增出清晰的带型。
[0010] 所述的香味基因fgr的特异引物如下所示： 正向引物 ff 序列（5' -3'）为 GGAGCTTGCTGATGTGTGTAAA， 反向引物 fr 序列（5' -3'）为 GGAAACAAACCTTAACCATAG ; 所述引物ff/fr扩增获得的DNA片段长度267bp为香味，DNA片段长度275bp为非香； 该引物可以有效鉴定水稻第8染色体上香味基因fgr中第7外显子是否有8 bp区段的 缺失； 所述的水稻红米基因Rc的特异引物如下所示： 正向引物 Rf 序列（5' -3'）为 CAGGCACCACACAGAGAATG， 反向引物 Rr 序列（5, -3'）为 CTCCTCTCTTTCAGCACATGG ; 所述引物Rf/Rr扩增获得的DNA片段长度161bp为白米，DNA片段长度175bp为红米； 该引物可以有效鉴定水稻第7染色体上红米基因Rc中第6外显子是否有14 bp区段的缺 失。
[0011] 所述的dNTPs浓度，在20 y 1体系中的each 2. 5mM dNTPs浓度最适用量为 0. 8 y 1〇
[0012] 所述的引物浓度，引物ff/fr终浓度为0. 1 yM，引物Rf/Rr终浓度为0. 07 yM。 本发明的有益效果是：与单个基因的标记检测方法相比，能够对水稻种质资源或育种 群体中香味基因fgr和红米基因Rc进行同步鉴定，并可在水稻抽穗前选择单株，用于杂交 或回交等，从而提高育种效率，且具有成本低、准确率高等优点。
【附图说明】
[0013] 图1香味基因引物ff/fr的PCR检测结果； 图2红米基因引物Rf/Rr的PCR检测结果； 图3红米和香味基因多重PCR体系优化结果； 图4多重PCR体系不同型条带电泳图； 图1、图2和图4中的R6、A01、R45、R55和R52均为水稻参试品系； 图3中1-5、6-10和11-15分别排列为1?6、六01、1?45、1?55和1?52; 图4中I型为红、非香型，II型为白、非香型，III型为白、香型，IV型为红、香型。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限 制本发明的范围。
[0015] 实施例1 单基因PCR反应体系 1. DNA提取：在田间水稻抽穗前抽取叶片，采用CTAB法提取DNA ; 2. PCR 体系均建立 20 y 1 体系，含：模板 DNA 2 y 1 (20-50ng)，10X buffer 2 y 1，25mM Mg2+ 1.2yl，each 2.5mM dNTPs 0.4yl，5U Taq 酶 0.3yl，引物 0.2yM，双蒸水补充至 20yl ;PCR扩增反应程序为：95°C预变性5 min;然后94°C变性458,55.5°(：复性458,721€ 延伸1 min，循环35个循环；最后72°C延伸7min，4°C保存；用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检 测； 表1本实验采用的引物
3. 红米与香米基因分子标记的两对引物在55. 5°C的退火温度，均能扩增出清晰的带 型，见图1和图2。
[0016] 实施例2 多重PCR反应体系