循环肿瘤细胞代谢活动检测方法和装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物与医学检测领域。更具体地，本发明涉及人外周血中循环肿瘤细胞代谢活动的检测方法和装置。本发明方法和装置可对人外周血中捕获到的CTC进行代谢功能分型，并用于预测这些CTC的恶性程度。
【背景技术】
[0002]人外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell, CTC)是指从肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。由于超过90%的癌症死亡是由转移造成的，而CTC是肿瘤转移的直接来源，因此从血液中分离CTC并对其进行分子检测越来越引起人们的重视。
[0003]目前对CTC的检测主要是对癌症患者外周血中的全体CTC进行计数，最具代表性的技术是目前唯一获得美国FDA批准的CellSearch系统，它被批准用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者外周血中CTC的。这一系统运用标记有针对EpCAM抗体的磁性颗粒对癌症患者7.5毫升血液中CTC进行捕获，然后通过细胞固定、透膜、以及三重的免疫荧光染色(DAP1、CK、⑶45)，将DAPI+/CK+/⑶45-且符合一定形态学标准的细胞定义为CTC并计数。临床试验(Cristofanilli M, Budd T, Ellis MJ, etal.N.Engl.J.Med.2004, 351, 781-791 ；Riethdorf S, Fritsche H, Muller V, et al.Clin.Cancer Res.2007, 13, 920-928 ；Cohen SJ，Punt CJAj Iannotti N，et al.J.Cl in.0ncol.2008，26，3213-3221)发现转移性乳腺癌、结肠癌和前列腺癌患者7.5毫升血液中检测到5个及以上的CTC预后较差，反之则预后较好，因此美国FDA在2004、2007与2008年分别批准CellSearch系统用于转移性乳腺癌、结直肠癌与前列腺癌的预后评估、无进展生存期和总生存期的预测，我国国家食品药品管理局在2012年8月批准CellSearch系统用于乳腺癌的预后评估。
[0004]然而，仅对全体CTC进行计数无法全面准确的反映肿瘤病灶当前的状态以及转移的风险，其原因在于研究发现CTC具有很大的功能异质性，相当一部分CTC处于凋亡状态，只有很小一部分CTC能够实现转移，这与临床上观察到的是一致的，因此临床上需要真正关注的是那一小部分具有高度活力与转移潜能的CTC。目前已有研究以活CTC (通过活细胞染料或分泌蛋白来确定细胞活性)数目或者活CTC占总CTC的比例为标志物进行临床研究探索CTC的应用领域，但细胞活性本身仍然与肿瘤细胞的恶性程度相关性较低，目前尚缺乏对CTC功能进行检测以确定CTC恶性程度与转移可能性的技术与设备。
[0005]因此，本领域迫切需要开发能够有效、快速地检测具有高度活性与恶性程度的CTC的技术。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是提供一种有效、快速地检测肿瘤患者血液中游离的CTC的恶性程度的方法以及检测设备。
[0007]在本发明的第一方面，提供了一种非诊断性地检测循环肿瘤细胞代谢活动的方法，包括步骤:
[0008](a)从外周血样品中富集分离循环肿瘤细胞CTC，从而得到分离到的循环肿瘤细胞 CTC ;
[0009](b)将上一步骤分离到的循环肿瘤细胞，置于微孔阵列芯片中，从而使得所述微孔阵列芯片的各个微孔中至多具有一个循环肿瘤细胞；
[0010](C)对上一步骤中的循环肿瘤细胞进行复苏处理，从而获得经复苏处理的循环肿瘤细胞；
[0011](d)在带有可检测标记物的葡萄糖类似物存在下，培养所述的经复苏处理的循环肿瘤细胞；和
[0012](e)检测所述循环肿瘤细胞对所述带有可检测标记物的葡萄糖类似物的摄取情况，从而定性或定量地确定所述循环肿瘤细胞代谢活动和/或恶性程度。
[0013]在另一优选例中，对所述葡萄糖类似物的摄取量高，就表示该循环肿瘤细胞的恶性程度高。
[0014]在另一优选例中，在步骤(C)和(d)之间，还包括步骤:对经复苏处理的循环肿瘤细胞进行饥饿处理。
[0015]在另一优选例中，步骤(C)中，在复苏处理中，还包括加入针对白细胞表面抗原的荧光修饰抗体(如ant1-CD45-FITC)以识别白细胞，从而将CTC与白细胞区分开。
[0016]在另一优选例中，步骤(C)中，在复苏处理中，还包括加入牛血清白蛋白对细胞、微孔芯片进行封闭，消除对2-NBDG的非特异性吸附。
[0017]在另一优选例中，步骤(C)中，在复苏处理中，加入死细胞染料(如EthD-1，ethdium homodimer-1)，从而识别出死细胞。
[0018]在另一优选例中，所述的饥饿处理是将所述循环肿瘤细胞置于低葡萄糖浓度或无葡萄糖的培养条件下，培养一段时间。
[0019]在另一优选例中，该饥饿处理的培养时间为1-60分钟，较佳地为2-30分钟，更佳地为5-20分钟。
[0020]在另一优选例中，所述的复苏处理包括选自下组的一种或多种:
[0021](i)物理环境复苏，其中所述物理环境复苏是指低氧环境，即氧气体积分数低于10% ；
[0022](ii)化学环境复苏，其中所述化学环境是指在含有细胞因子的细胞培养液下培养，其中所述的细胞因子包括表皮生长因子、纤维细胞生长因子或其组合；
[0023](iii)肿瘤细胞培养上清液复苏。
[0024]在另一优选例中，所述的可检测标记物包括化学修饰基团。
[0025]在另一优选例中，所述的可检测标记物包括荧光基团、生物素。
[0026]在另一优选例中，所述的带有可检测标记物的葡萄糖类似物为2-NBDG。
[0027]在另一优选例中，所述的外周血样品为来自哺乳动物(如人)的样品。
[0028]在另一优选例中，在步骤(a)中，从外周血中富集分离循环肿瘤细胞是通过免疫磁珠法进行分离，其中免疫磁珠上负载有与肿瘤表面抗原特异性结合的抗体。
[0029]在另一优选例中，在步骤(a)中，通过鱼骨形芯片分离捕获法进行分离。
[0030]在另一优选例中，在步骤(a)中，使用图4所示结构的鱼骨形芯片进行分离。
[0031]在另一优选例中，在步骤(a)中从外周血样品中富集分离到的循环肿瘤细胞CTC的数量为nl ;而在步骤(b)中，所述微孔阵列芯片的微孔数量为n2，并且n2/nl的比值彡10。
[0032]在另一优选例中，n2/nl的比值彡20，更佳地n2/nl的比值彡100。
[0033]在另一优选例中，在步骤(b)中，将步骤(a)获得的循环肿瘤细胞的悬浮液加到所述微孔阵列芯片，并施加磁场使所述循环肿瘤细胞进入微孔，从而保证葡萄糖摄取检测试验样本不丢失。
[0034]在另一优选例中，在步骤(e)中，先清洗去多余的所述葡萄糖类似物，然后根据被摄取进入循环肿瘤细胞的所述葡萄糖类似物的信号，表征该循环肿瘤细胞摄取葡萄糖的能力。
[0035]在另一优选例中，在所述清洗去多余的所述葡萄糖类似物的过程中，是在施加磁场的情况下进行，从而确保循环肿瘤细胞被固定在基底上从而不被洗脱。
[0036]在另一优选例中，在步骤(b)至(e)中，所述的循环肿瘤细胞的细胞表面结合有磁珠。
[0037]在另一优选例中，在另一优选例中，所述的分离到的循环肿瘤细胞CTC的表面结合有免疫磁珠。
[0038]在另一优选例中，在步骤(d)中，所述葡萄糖类似物与循环肿瘤细胞共培养的时间为2分钟至2小时，更佳地为5分钟至I小时。
[0039]在另一优选例中，在步骤(e)中，对摄取进入循环肿瘤细胞的葡萄糖类似物量的检测通过荧光信号或光谱信号。
[0040]在另一优选例中，在步骤(a)中，所述的外周血样品是(i)未经任何处理的外周血样品；或(ii)未经去除红细胞处理和/或未经去除白细胞处理的外周血样品。
[0041]在另一优选例中，所述的外周血样品是经低速离心去除血小板和血浆的外周血样品O
[0042]在另一优选例中，在步骤(e)中，还包括:与参考值或标准曲线进行比较，从而定性或定量地确定所述循环肿瘤细胞代谢活动水平。
[0043]在本发明的第二方面，提供了一种用于检测循环肿瘤细胞代谢活动的装置，所述装置包括:
[0044](a)鱼骨形芯片；
[0045](b)微孔阵列芯片；
[0046](c)第一容器，以及置于所述第一容器中的带有可检测标记物的葡萄糖类似物；
[0047](d)任选的用于捕获循环肿瘤细胞的磁珠，所述磁珠上负载有与肿瘤表面抗原特异性结合的抗体；和
[0048](e)任选的磁场装置，所述磁场装置包括永久磁铁或电磁铁。
[0049]在另一优选例中，所述的装置还包括:
[0050](f)第二容器，以及位于所述第二容器内的封闭剂(如牛血清白蛋白)。
[0051]在另一优选例中，所述的装置还包括:
[0052](g)第三容器，以及位于所述第三容器内的用于区分循环肿瘤细胞和白细胞的抗体，例如针对白细胞表面抗原的荧光修饰抗体(如ant1-CD45-FITC)。
[0053]在另一优选例中，所述的装置还包括:
[0054](h)第四容器，以及位于所述第四容器内的用于识别死细胞的死细胞染料(如EthD-1，ethdium homodimer-1)。
[0055]在另一优