通过尖孢镰刀菌发酵改性小百部富集红苋甾酮的新方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物改性植物化学成分领域，具体来说是建立了一种通过植物病原 真菌尖孢镰刀菌改性小百部来大量富集红苋留酮的方法。
【背景技术】
[0002] 小百部又名滇百部，为百合科（ZiJiaceae)天门冬属植物羊齿天门 冬乂/YJici/ws Buch. - Ham. ex D. Don的块根，主产于云南和四川，为云南彝 族和傣族的习用药物。其味甘苦，性平，民间多用于治疗气管炎，肺炎和咳嗽，在云南省的一 些地区，也作为中药百部的代用品。现代药理学研究表明小百部具有较强的抗肿瘤作用，超 过了同属植物抗癌保健药芦笋，同时还具有显著的抗二氧化硫毒气、抑菌以及镇咳等药理 活性，是一种具有良好开发前景的天然药物。有关该属植物化学成分研究表明，留体皂苷为 该属植物主要成分。迄今为止，已经发现了 12个留体皂苷、5个蜕皮留酮类化合物、2个木 脂素类化合物和1个苯丙素类化合物。其中蜕皮留酮、20-羟基蜕皮留酮、stachysterone C、20, 22-异丙亚二氧基蜕皮留酮这四种化合物含有相同的母核结构。
[0003] 红苋甾酮（沿/Arasterete)是一种含有19个碳的植物甾酮类化合物，它于1963年 首次从牛膝中分离得到。前期研究表明红苋留酮具有较强的抗糖尿病活性，在离体条件下 诱导果蝇器官芽外翻，并且高效的刺激小鼠肝脏蛋白质的合成。毫无疑问，红苋留酮还可能 具有更多的其它生物活性以及应用开发价值。但是，到目前为止，能够分离得到红苋留酮的 生物种类有限，分离过程也比较繁杂。而红苋留酮的合成过程也相当复杂，根据目前的报 道，可以以 dehydroepiandrosterone 或 3 〇，5 a -cycloandrostane-6, 17-dione 为底物分 别通过20步或7步合成得到。
[0004] 然而，合成过程也需要用到复杂的生产设备，对生产环境也有相当高的要求，并且 转化率较低。因此，我们更需要一种简便易行的，绿色无污染的，高效的产生红苋留酮的方 法。
[0005] 近年来，因为微生物生长周期短、避免了因条件剧烈而产生不必要的副反应的特 点以及微生物转化反应条件温和、副产物少、立体选择性强等优点，利用微生物(真菌、细菌 以及藻类)发酵改性的方法越来越受到人们的重视。在实际生产中，已经有大量的应用实例 通过微生物的发酵来生产一些新颖的、活性较高的以及对人体健康有益的食品或药物等。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在通过植物病原真菌尖孢镰刀菌发酵改性传统中药材小百部，从而达到 高效富集红苋留酮的目的，本发明克服了红苋留酮在常规中药材中含量少，合成成本高，合 成过程复杂，转化率低等缺点，提供了一种转化率高，设备要求低，简便易操作，绿色无污 染，适合产业化生产的富集红苋留酮的方法。
[0007] 本发明另一个目的在于利用植物病原真菌尖孢镰刀菌来发酵改性小百部，从而达 到了高效富集红苋留酮的效果。此种方法简便易行，对设备要求低，绿色无污染，是一种非 常适用于工业化生产的方法。
[0008] 本发明的目的是通过以下具体技术方案实现的： 尖孢镰刀菌的活化： 本发明所用的尖孢镰刀菌首先进行活化，即将尖孢镰刀菌接种到经过121 ° C高温灭 菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养1-7 d后置于4 ° C冰箱中。
[0009] 药材前处理： 取干燥的小百部药材粉碎后，取适量的药材粉末置于锥形瓶中，加入自来水浸润后， 观察药材的湿润度。将装有药材的锥形瓶加塞包装后置于121 ° C高温灭菌箱中灭菌30 min，取出后将药材冷却。
[0010] 药材接菌： 将活化好的尖孢镰刀菌菌丝在无菌环境下接种到经过前处理的小百部上，加塞包装后 置于培养箱中培养5-20 d后取出。
[0011] 提取、分离、纯化： 微生物发酵后的小百部经过甲醇溶液超声提取，过滤，浓缩得到粗提物。经TLC (薄层 层析法）薄层层析法检测，分别与原药材和空白发酵组进行对照。然后经过硅胶柱进行分 离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇(此二元溶剂的体积比由90:1逐渐变动为 3:1)，再将这部分用石油醚：丙酮(此二元溶剂的体积比由6:1逐渐变动为2:1)洗脱，然后 经分离得到的化合物上凝胶柱纯化，通过iH-NMR (核磁共振氢谱)，13C-NMR (核磁共振碳谱） 以及HR-ESI-MS (电喷雾高分辨率质谱）鉴定得到化合物结构。
[0012] 分离得到的红苋甾酮（沿/Arosterete)和前体化合物20-羟基銳皮甾酮 (2〇-hydroxyecdysone)的结构式如下：
其中所述浸润小百部的自来水量要刚好使药材保持湿润状态。
[0013] 用于提取的甲醇溶液为体积比为40%_90%的水溶液。
[0014] 采用本发明微生物发酵小百部富集红苋留酮的方法，与现有技术相比，本发明的 制备方法优点在于： (1) 选用小百部为原料，一步催化反应即可转化生成红苋甾酮； (2) 选用微生物酶为催化剂，其本质是蛋白质，具有强的区域选择性，立体选择性和高 度的专一性，而且催化反应条件温和，不需要化学试剂的参与以及化学反应的高温高压等 条件。
[0015] 综上所述，该发明方法采用的原料便宜易得，反应条件温和、容易控制，环境无污 染，设备要求简单，适宜扩大化生产的富集红苋留酮的工艺方法。
[0016]
【附图说明】： 图1为本发明中目标化合物的1H-NMR ; 图2为本发明中目标化合物的13C-NMR ; 图3为本发明中目标化合物的HR-ESI-MS ; 图4为本发明中原药材粗提物、空白发酵粗提物、尖孢镰刀菌发酵粗提物、20-羟基蜕 皮甾酮以及红苋留酮的分析色谱图；其中（a)是20-羟基蜕皮留酮的分析色谱图、（b)是原 药材粗提物的分析色谱图、（c)是空白发酵粗提物的分析色谱图、（d)是红苋留酮的分析色 谱图、（e)是尖孢镰刀菌发酵粗提物的分析色谱图。
[0017]
【具体实施方式】： 下面结合实施例进一步阐述本发明，但本发明不局限于该具体实施例，本领域技术人 员应该认识到，本发明涵盖了权利要求范围内的所有可能的备选方案、改进方案和等效方 案。
[0018] 实施例1 1.菌种和药材： 植物病原真菌尖孢镰刀菌是由云南省微生物研究所提供，小百 部于2013年11月购自于昆明药材市场。
[0019] 2?菌种活化： 植物病原真菌尖孢镰刀菌首先必须在培养基上进行活化，即将尖孢镰刀菌接种到121 ° (：高温灭菌处理的PDA斜面培养基上，在培养箱中培养1-7 d后取出放在4 ° C冰箱中， 备用。
[0020] 3?药材前处理： 称取药材粉末于锥形瓶中，用适量自来水润湿，加塞包装后置于121 ° C高温灭菌箱 中灭菌30 min。
[0021] 4?药材接菌： 尖孢镰刀菌菌丝在无菌环境下接种到经过前处理的小百部上，加塞包装后置于25-37 ° C的培养箱中培养5-20 d后取出。
[0022] 5?提取： 微生物发酵后的小百部经过甲醇溶液超声提取，过滤，浓缩得到粗提物。