胶原蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物食品技术领域。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是人体内含量最丰富的蛋白质，占全身总蛋白质的30%以上。胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等氨基酸。胶原蛋白是细胞外基质中最重要的组成部分。由于胶原蛋白具有紧肤平皱、保湿滋润、修复组织、美白淡斑等功效，一直被人们食用、医用等，胶原蛋白一般在猪皮、牛皮等中提取，现有常规方法的制备胶原蛋白受工艺条件等影响，提纯率较低，而且提取出来的胶原蛋白中杂质较多，严重影响了胶原蛋白的质量。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种以牛皮为主要原料来制备胶原蛋白的制备方法。
[0004]本发明的胶原蛋白原液的制备步骤是:
a、勾楽消化:
牛真皮组织解冻
取冻存的牛真皮组织，加入超纯水浸泡，直到牛真皮解冻成松散的组织颗粒，用玻璃棒搅拌均匀，成糊状；将糊状的组织颗粒再加入10倍体积的超纯水，按组织捣碎机的操作规程匀浆3次，至完全悬浮；将组织颗粒绞碎均匀后加入超纯水至组织的含量为25克/升，混匀；
加冰醋酸至组织悬浮液，调制溶液浓度0.5毫克/毫升；
消化:称取胃蛋白酶，将胃蛋白酶溶于0.5M醋酸中制成10mg/ml的胃蛋白酶溶液，然后转入到组织悬浮液至0.lmg/ml，即每10ml匀浆中加入Iml的胃蛋白酶溶液，混匀，室温消化7-10天；
b、吸附过滤:
用配置好的1M NaOH标准溶液调节消化液pH至9一9.5，静置过夜，灭活胃蛋白酶；调节PH值:消化液中加入等体积的超纯水，并用浓盐酸调节pH到4.0，搅拌2小时；清洗娃藻土:根据调节pH值后的消化液体积，按浓度为15g/L称取娃藻土，将娃藻土用1mM HCl浸泡2小时，用超纯水清洗数次；
吸附过滤:加硅藻土至消化液，混匀，静置2小时；将滤纸置于过滤器中，把过滤器和循环卫生栗用硅胶管连接紧密，按过滤器和循环卫生栗的标准操作规程进行过滤，滤除硅藻土，得消化过滤液；
C、超滤浓缩换缓冲液:
用超滤系统浓缩过滤后的消化过滤液，并用20mmol/LpH4.6醋酸缓冲液反复换液3
次；
d、离子交换层析: 装柱:将阳离子交换介质用0.5mol/L NaOH溶液浸泡过夜，用去离子水漂洗至pH值彡8.0 ;将洁净的层析柱与卫生栗相连接，将柱内充入大约1/5柱床体积的20mmol/L NaAc,PH4.6缓冲液，将上述处理的阳离子交换介质用同种缓冲液调成糊状后，沿柱的内壁注入柱内，待凝胶自然沉积约数厘米后，开动卫生栗，调节流速在10ml/min左右，用50mmol/L，pH4.6 NaAc缓冲液平衡层析柱，至少3倍体积；
离子交换层析柱清洗再生:用0.5mol/L NaOH溶液冲洗半小时以上，后用超纯水冲洗至pH值彡8.0 ;再将层析柱用0.5mol/L HCl溶液冲洗半小时以上，后用超纯水冲洗至pH值彡6.0 ;再将层析柱用50mmol/L NaAc, pH4.6缓冲液冲洗平衡，至少3倍柱体积；
上样:用卫生栗将粗提胶原蛋白溶液缓慢注入到层析柱中，用220mn紫外监测器监测，上样量以胶原蛋白5mg/ml离子交换介质计算；
冲洗未吸附胶原蛋白和杂蛋白:用20mmol/L NaAc，pH4.6缓冲液冲洗未吸附胶原蛋白和杂蛋白至少2倍柱体积，冲洗速度为30ml/min左右；
洗脱吸附胶原蛋白:用含lOOmmol/L NaCl的20mmol/L、pH4.6 NaAc缓冲液洗脱，收集洗脱峰的蛋白，即胶原溶液，洗脱速度为25ml/min左右，洗脱缓冲液约3柱倍体积；
e、超滤浓缩换保存液:
对超滤系统进行冲洗、清洗、膜堆的完整性检测、消毒除热原；浓缩离子交换层析洗脱的收集液溶液并用lOmmol/L盐酸溶液反复换液3次；
f、过滤除菌:
用除菌过滤系统清洗、安装滤膜后对滤器进行高温蒸汽灭菌，灭菌后冷却至室温；将除菌后溶液的容器密封，4°C冰柜保存，除菌过滤溶液即为最终产品的胶原蛋白原液。
[0005]本发明用胶原蛋白原液制备胶原蛋白的制备步骤是:
a、蛋白沉淀:
在除菌后胶原原液中加入1/10体积的0.2mol/L、pHll.2 Na2HPO4缓冲溶液，用pH计测定混合液的PH值应在7.0-7.5之间，溶液由无色透明变为乳白色，室温下过夜；
b、离心:
用超低温高速离心机，10000rpm/min，离心胶原纤维30分钟；收集离心沉淀胶原纤维和上清液，用灭菌生理食盐水洗涤胶原纤维，10000rpm/min,离心30分钟，收集上清液并与前次上清液混合，收集胶原纤维，送检以检测蛋白浓度；
C、匀浆纤维
用离心前胶原原液和离心沉淀后上清液的胶原蛋白浓度，按胶原蛋白浓度35mg/ml计算出离心后胶原纤维的匀浆液半成品的体积；
公式:匀浆液半成品体积=(胶原原液浓度*胶原原液体积-离心上清液浓度*上清液体积)/35
用确定后匀浆液的体积，按盐酸利多卡因浓度3mg/ml计算出盐酸利多卡因需要量:公式:盐酸利多卡因溶液量=匀浆液半成品体积*3/20 ;
将胶原纤维沉淀分别转入胶原纤维匀浆乳化器中；
加入生理盐水和盐酸利多卡因溶液，最终定容到计算量体积；
利用胶原纤维匀浆乳化器的乳化头另一只胶原纤维匀浆乳化器的乳化头进行连接，推动胶原纤维通过胶原纤维匀浆乳化器的乳化头多次，使胶原纤维充分匀浆混匀。
[0006]本发明工艺简单，操作容易，经过本发明工艺将牛皮进行处理后获得的浆液用于进行胶原蛋白的提取，能够明显增加胶原蛋白的提纯率和纯度。
【附图说明】
[0007]图1是本发明工艺流程图。
[0008]【具体实施方式】、
本发明的胶原蛋白制备步骤是:
a、勾楽消化:
牛真皮组织解冻
取冻存的牛真皮组织，加入超纯水浸泡，直到牛真皮解冻成松散的组织颗粒，用玻璃棒搅拌均匀，成糊状；将糊状的组织颗粒再加入10倍体积的超纯水，按组织捣碎机的操作规程匀浆3次，至完全悬浮；将组织颗粒绞碎均匀后加入超纯水至组织的含量为25克/升，混匀；
加冰醋酸至组织悬浮液，调制溶液浓度0.5毫克/毫升；
消化:称取胃蛋白酶，将胃蛋白酶溶于0.5M醋酸中制成10mg/ml的胃蛋白酶溶液，然后转入到组织悬浮液至0.lmg/ml,即每10ml匀浆中加入Iml的胃蛋白酶溶液，混匀，室温消化7-10天；
b、吸附过滤:
用配置好的1M NaOH标准溶液调节消化液pH至9一9.5，静置过夜，灭活胃蛋白酶；调节PH值:消化液中加入等体积的超纯水，并用浓盐酸调节pH到4.0，搅拌2小时；清洗娃藻土:根据调节pH值后的消化液体积，按浓度为15g/L称取娃藻土，将娃藻土用1mM HCl浸泡2小时，用超纯水清洗数次；
吸附过滤:加硅藻土至消化液，混匀，静置2小时；将滤纸置于过滤器中，把过滤器和循环卫生栗用硅胶管连接紧密，按过滤器和循环卫生栗的标准操作规程进行过滤，滤除硅藻土，得消化过滤液；
C、超滤浓缩换缓冲液:
用超滤系统浓缩过滤后的消化过滤液，并用20mmol/LpH4.6醋酸缓冲液反复换液3
次；
d、尚子父换层析:
装柱:将阳交换