个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的；
[0040] 2)对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据插入序列之间的汉 明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列 的汉明距离不超过3,以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；
[0041] 3)对于每个DNA模板扩增形成的系列重复片段中的测序序列的每一个测序碱基 进行互相比对，若某种碱基型在测序序列中的一致率达到80 %，则记新测序序列的这个碱 基为此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列，通过这种 方法矫正，可以有效去除测序和PCR中随机引入的错误，提尚检测的准确性；
[0042] 4)对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列；
[0043] 5)根据4)中得到的测序序列与頂GT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考 序列进行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计 定量；
[0044] 6)根据5)的结果进行其他相关分析。
[0045] 本发明提供了上述检测系统在检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库中的应用。
[0046] 本发明提供了上述方法以及上述检测系统在制备疾病筛查试剂盒中的应用。
[0047] 进一步地，所述的疾病为肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病。
[0048] 本发明提供了上述方法以及上述检测系统在制备评价免疫系统功能例如干细胞 和/或器官移植的试剂盒中的应用。
[0049] 本发明还提供了一种用于检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的引物组合， 含有3组引物，第一组引物含有的引物序列分别如SEQIDNO. 1-28所示；第二组引物含 有的引物序列分别如SEQIDNO. 29-77所示；第三组引物含有的引物序列分别如SEQID NO. 78-79 所示。
[0050]上述第一组、第二组引物在本发明的实施例中统称为PCRl引物体系，第三组引物 称为PCR2引物体系，PCRl引物体系是基于BCR和TCR分别进行设计，目的是将全长的BCR H链以及TCRBeta链⑶R3区全部扩增出。BCR的免疫多态性基于V(D)J区片段的重组排 列；TCRCDR3区刚好覆盖TRBV-Junction-TRBD-Junction-TRBJ区域，由于变异最大，从而 直接决定了TCR的抗原特异性。
[0051] PCR2引物体系为BCR/TCR第二轮PCR时的通用引物，其基于PCRl产物为模板，通 过引物引入测序标签以及测序序列，完成文库的构建。
[0052] 针对BCR和TCR的PCRl的引物结构：从5'端到3'端均依次包含接头序列、特异 性的标签序列和BCR/TCR扩增的上下游引物。
[0053]BCR扩增的上下游引物设计：根据对BCRV基因7大类家族0RF(分别为FR1、⑶RU FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4)的同源性分析，以V基因的leader区设计的上游引物（总共 22 条，如SEQIDNO. 1-22 所示）和根据BCRmIgG、mIgA、mIgM、mIgE或mlgD的C区基因序 列的特征分别设计的至少一种下游引物（总共6条，如SEQIDNO. 23-28所示）。详情见表 1〇
[0054]TCR扩增上下游引物设计：人TCRP链V基因家族包含45个功能性基因家族和7 个0RF，根据52个基因的同源性总共设计45条上游引物（如SEQIDNO. 29-73所示）；而 人TCRP链的C基因高度同源，因此设计4条不同的通用下游引物（如SEQIDNO. 74-77 所示），随机与46条上游引物配对，以避免由于血浆片段随机断裂原因导致扩增失败，提高 片段扩增的成功率。详情见表2。
[0055] PCRl上下游引物均具有的特点为：⑴接头序列以现有成熟的Illumina平台为参 考设计，上游引物为34bp，下游引物为33bp; (2)特异性的标签序列：根据数据经验分析显 示设置为7个随机碱基组成的序列，将更有利于获得较高的数据利用率。其产生的4 7种标 签组合，完全满足对每个DNA模板分子的标记。（3)基于血浆片段平均170bp的特点，为更 有效实现对血浆片段的扩增，上下游引物长度尽量控制在16bp左右。
[0056]BCR和TCR-PCR2的引物结构：PCR2引物体系中，上下游引物的基础引物序列分别 与PCRl引物体系的产物两端的接头序列互补，同时其上游引物只包含测序序列，而下游引 物则包含测序序列以及测序标签一一8个已知固定碱基（index)，用于进行混合测序样品间 的区分。详情见表3。
[0057] 本发明提供了上述引物组合在制备疾病筛查试剂盒或诊断试剂中的应用。
[0058] 本发明提供了一种检测血浆CfDNA中BCR和TCR免疫组库的试剂盒，其含有本发 明所述的引物组合。
[0059] 本发明提供的检测血浆CfDNA中BCR和TCR免疫组库方法具有全面、高效、精准、 便捷的特点，相对于现有技术，本发明引入标签编码技术并进行优化，基于7个随机碱基构 成的唯一标签，同时设定每个小簇中任意两对成对测序序列的汉明距离不超过3,满足对每 个模板进行了标记，实现更高的数据利用效率，不仅可以矫正测序和PCR中引入的错误，而 且根据对每个模板的唯一标记，可以最大化的实现无偏好性的数据分析，实现免疫组库各 亚克隆的精准定量。本发明方法通过检测血浆中不同亚克隆细胞凋亡释放到血中DNA片段 的BCR和TCR的基因序列，分析其多态性，为免疫系统疾病的早期筛查与愈后指导用药提供 技术支持。另一方面，本发明设计的引物几乎囊括了针对所有BCR H链VDJ的免疫多态性 以及TCR Beta链CDR3区的免疫多态性的序列，从而可以更全面准确的进行免疫状态的评 估，可用于制备检测恶性肿瘤、自身免疫系统疾病的试剂盒，也可用于干细胞移植和器官移 植领域对机体的免疫功能进行全面评价，在无创检测领域具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0060] 图1为本发明检测方法的流程图。
[0061] 图2为采用本发明检测方法对肺腺癌患者血浆CfDNA的TCR免疫多态性检测结 果。
[0062] 图3为采用本发明检测方法对肺腺癌患者血浆CfDNA的BCR聚类分析检测结果。
【具体实施方式】
[0063] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0064] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明实施例中采用的测序装置为Illumina HiSeq2500,本发明测序步骤中，不限于该测序装置。
[0065] 实施例1检测血浆cfDNA中BCR和TCR的引物的设计
[0066]BCR的免疫多态性基于V(D)J区片段的重组排列。TCR⑶R3区刚好覆盖 TRBV-Junction-TRBD-Junction-TRBJ区域，由于变异最大，从而直接决定了TCR的抗原特 异性。针对BCR和TCR基因序列分别进行引物设计，目的是将全长的BCRH链以及TCRBeta 链⑶R3区全部扩增出。
[0067] BCR/TCR-PCR1的引物结构：从5'端到3'端均依次包含接头序列、特异性的标签 序列和BCR/TCR扩增的上下游引物。
[0068]BCR扩增的上下游引物设计：根据对BCRV基因7大类家族0RF(分别为FR1、⑶RU FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4)的同源性分析，以V基因的Ieader区设计的上游引物（总共22 条，见表1的B-PCRl上游引物，或如SEQIDNO. 1-22所示）和根据BCRmIgG、mIgA、mIgM、 mlgE或mlgD的C区基因序列的特征分别设计的至少一种下游引物（总共6条，见表1的 B-PCRl下游引物，或如SEQIDNO. 23-28所示）。