准信息分析。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中BCR H链全长多重PCR扩增 采用的上游引物共22条，序列分别如SEQ ID NO. 1-22所示，下游引物共6条，序列分别如 SEQ ID NO. 23-28 所示； TCR链CDR3多重PCR扩增采用的上游引物共45条，序列分别如SEQ ID NO. 29-73所 示，下游引物共4条，序列分别如SEQ ID NO. 74-77所示。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，各条上游引物的浓度相同，各 条下游引物的浓度相同，且下游单个引物浓度为上游单个引物浓度的20倍。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2)中BCR H链全长多重PCR扩增条 件为：98°(：预变性458;98°(：变性158,60°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8，共8个循环 ；72°(：终延 伸60s ;4°C保持。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2)中TCR P链CDR3多重PCR扩增 条件为：98°C预变性45s ;98°C变性15s，54°C退火30s，72°C延伸30s，共8个循环；72°C终 延伸60s ;4°C保持。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑶所述的两种扩增产物分别是指 BCR H链全长多重PCR扩增产物中片段大小在300-350bp的片段回收纯化后的产物、以及 TCRI3链⑶R3多重PCR扩增产物中片段大小在200-250bp的片段回收纯化后的产物。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3)中将步骤（2)的两种扩增产物等 体积混合后再进行一次PCR扩增；所采用的引物序列如SEQ ID NO. 78-79所示。8. 根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，步骤（3)中PCR反应程序为：98°C 预变性45s ;98°C变性15s，65°C退火30s，72°C延伸30s，共15个循环；72°C终延伸60s ;4°C 保持。9. 根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，步骤（5)的免疫组库精准信息分析 包括以下步骤： 1) 基于已知接头序列确定7个随机碱基N的位置，7个随机碱基可以形成47种唯一 标签，将成对测序序列的测序序列1和测序序列2的唯一标签序列首尾相连，形成14bp的 一条索引，并且以这14bp作为的成对测序序列索引进行外部排序，以达到将来源于同一个 DNA _吴板的所有测序序列聚集到一起的目的； 2) 对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据插入序列之间的汉明距 离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉 明距离不超过3,以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的； 3) 对于每个DNA模板扩增形成的系列重复片段中的测序序列的每一个测序碱基进行 互相比对，若某种碱基型在测序序列中的一致率达到80 %，则记新测序序列的这个碱基为 此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列，通过这种方法 矫正，可以有效去除测序和PCR中随机引入的错误，提尚检测的准确性； 4) 对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列； 5) 根据4)中得到的测序序列与頂GT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进 行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计定量； 6) 根据5)的结果进行序列结构分析，免疫组库表达谱分析、Biomarker分析。10. -种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的系统，包括以下操作单元： (1) 血浆cfDNA提取单元； (2) BCR H链全长多重PCR扩增和TCR P链⑶R3多重PCR扩增单元； (3) 步骤（2)中两种扩增产物混合后再进行一次PCR扩增单元； (4) 高通量测序单元； (5) 免疫组库精准信息分析单元。11. 如权利要求10所述的系统，其特征在于，所述单元（2)中BCR H链全长多重PCR扩 增采用的上游引物共22条，序列分别如SEQ ID NO. 1-22所示，下游引物共6条，序列分别 如 SEQ ID NO. 23-28 所示； TCR 链CDR3多重PCR扩增采用的上游引物共45条，序列分别如SEQ ID NO. 29-73所 示，下游引物共4条，序列分别如SEQ ID NO. 74-77所示。12. 如权利要求10所述的系统，其特征在于，单元（3)中是将单元（2)的两种扩增产物 等体积混合后再进行一次PCR扩增；所采用的引物序列如SEQ ID NO. 78-79所示。13. 如权利要求10所述的系统，其特征在于，单元（5)的免疫组库精准信息分析包括以 下步骤： 1) 基于已知接头序列确定7个随机碱基N的位置，7个随机碱基可以形成47种唯一 标签，将成对测序序列的测序序列1和测序序列2的唯一标签序列首尾相连，形成14bp的 一条索引，并且以这14bp作为的成对测序序列索引进行外部排序，以达到将来源于同一个 DNA _吴板的所有测序序列聚集到一起的目的； 2) 对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据插入序列之间的汉明距 离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉 明距离不超过3,以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的； 3) 对于每个DNA模板扩增形成的系列重复片段中的测序序列的每一个测序碱基进行 互相比对，若某种碱基型在测序序列中的一致率达到80 %，则记新测序序列的这个碱基为 此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列，通过这种方法 矫正，可以有效去除测序和PCR中随机引入的错误，提尚检测的准确性； 4) 对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列； 5) 根据4)中得到的测序序列与頂GT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进 行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计定量； 6) 根据5)的结果进行其他相关分析。14. 权利要求10-13任一所述的系统在检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的应用。15. 权利要求1-9任一所述的方法或权利要求10-13任一所述的系统在制备疾病筛查 试剂盒中的应用。16. 如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的疾病为肿瘤、自身免疫性疾病、感 染性疾病。17.权利要求1-9任一所述的方法或权利要求10-13任一所述的系统在制备评价免疫 系统功能试剂盒中的应用。18. -种用于检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的引物组合，含有3组引物，第一 组引物含有的引物序列分别如SEQ ID NO. 1-28所示；第二组引物含有的引物序列分别如 SEQ ID NO. 29-77所示；第三组引物含有的引物序列分别如SEQ ID NO. 78-79所示。19.权利要求18所述的引物组合在制备疾病筛查试剂盒或诊断试剂中的应用。20. -种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的试剂盒，其含有权利要求18所述的 引物组合。
【专利摘要】本发明提供了一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法，包括以下步骤：血浆cfDNA提取、BCR？H链的全长多重PCR扩增和TCRβ链CDR3多重PCR扩增、两种扩增产物等体积混合后再进行一次PCR扩增、高通量测序、免疫组库精准信息分析。上述三次PCR扩增的引物分别如SEQ？ID？NO.1-28、SEQ？ID？NO.29-77、SEQ？ID？NO.78-79所示。本发明还提供了含有上述引物的检测血浆cfDNA中BCR和TCR的试剂盒。本发明方法以及试剂盒能够同时检测血浆cfDNA中BCR和TCR，实现精准信息分析和免疫组库各亚克隆的精确定量，在无创检测领域具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105087789
【申请号】CN201510488029
【发明人】易鑫, 吕小星, 赵美茹, 管彦芳, 刘涛, 杨玲
【申请人】北京吉因加科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月10日