[0069]TCR扩增上下游引物设计：人TCRP链V基因家族包含45个功能性基因家族和7 个0RF，根据52个基因的同源性总共设计45条上游引物（见表2的T-PCRl上游引物，或如 SEQIDNO. 29-73所示）；而人TCRI3链的C基因高度同源，因此设计4条不同的通用下游 引物（见表2的T-PCRl下游引物，或如SEQIDNO. 74-77所示），随机与46条上游引物配 对，以避免由于血浆片段随机断裂原因导致扩增失败，提高片段扩增的成功率。
[0070] 表IBCR-PCRl引物体系
[0071]
[0077] BCR/TCR-PCR2的引物结构：PCR2上下游引物的基础引物序列分别与PCRl的产物 两端的接头序列互补，同时其上游引物只包含测序序列，而下游引物则包含测序序列以及 测序标签一一8个已知固定碱基（index)，以用于进行混合测序样品间的区分。详情见表3。
[0078] 表 3BCR/TCR-PCR2 引物体系
[0079]
[0080] 实施例2检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库方法的建立
[0081] 1、血浆cfDNA提取：
[0082]Ll提取血浆抽取受检者外周血2管（5mL/管）于EDTA抗凝管中，轻柔上下颠 倒（防止细胞破裂），6-8次充分混匀，在采血当天4-6小时内进行以下处理；在4°C条件下 1600g离心10分钟，离心后将上清（血浆）分装到多个I. 5mL/2mL离心管中，在吸取过程中 不能吸到中间层白细胞；在4°C条件下16000g离心10分钟，去除残余细胞，将上清（血浆） 转移到新的I. 5mL/2mL离心管中，不能吸到管底白细胞，即得到分离后所需血浆。
[0083]I. 2血浆样本处理完后，分离得到的血浆及剩余血细胞均保存到_80°C冰箱中，避 免反复冻融。
[0084] 1. 3血浆cfDNA/ctDNA的提取与定量：取分离出的血浆约2-3ml，按照QIAamp CirculatingNucleicAcidKit(Qiagen)提取试剂说明书，进行血衆cfDNA的提取。 Qubit(Invitrogen，theQuant-iTTMdsDNAHSAssayKit)定量所提取的DNA，总量约为 30 ~50ng。
[0085] 2、分别进行BCR/TCR多重PCRl扩增
[0086] 2. 1分别将实施例1中的表1和表2中的上下游引物进行混合，形成BCR和TCR上 下游引物MIX，且下游单个引物浓度为上游单个引物浓度的20倍。
[0087] 2. 2BCRH链全长多重PCRl反应扩增，基于QIAGEN公司MultiplexPCR试剂盒进 行操作：
[0088]
[0089] 上述PCR反应体系中，B-PCRl上游引物序列分别如SEQIDNO. 1-22所示，B-PCRl 下游引物序列分别如SEQIDNO. 23-28所示，其中B-PCRl上、下游引物Mix中各条引物为 等体积等浓度混合。
[0090]BCRH链全长多重PCR扩增条件为：98°C预变性45s;98°C变性15s，60°C退火30s， 72°C延伸30s，共8个循环；72°C终延伸60s;4°C保持。
[0091] 2. 3TCRP链0?3区多重PCRl反应扩增，基于QIAGEN公司MultiplexPCR试剂盒 进行操作：
[0092]
[0093] 上述PCR反应体系中，TCRCDR3PCRl上游引物序列分别如SEQIDNO. 29-74所 示，TCRCDR3PCRl下游引物序列分别如SEQIDNO. 75-78所示，其中上、下游引物Mix中 各条引物为等体积等浓度混合。
[0094]TCRP链0?3多重PCR扩增条件为：98°C预变性45s;98°C变性15s，54°C退火 30s，72°C延伸30s，共8个循环；72°C终延伸60s;4°C保持。
[0095] 2. 4使用TBE-PAGE胶电泳上述扩增获得的PCR产物，分别获取片段大小在300bp 或190bp左右的片段，按照QIAquickGelExtractionKit(Qiagen)试剂说明书进行产量 回收，获取BCR/TCRPCRl的扩增产物，之后采用Qubit(Invitrogen，theQuant-iTdsDNA BRAssayKit)进行定量。
[0096] 3、扩增产物等比例混合进行PCR2扩增：针对同一样品，等比例各取50ngBCR和 TCR的PCRl纯化产物，进行PCR2扩增，反应体系如下：
[0097]
[0098]PCR反应程序为：98°C预变性45s;98°C变性15s，65°C退火30s，72°C延伸30s，共 15个循环；72°C终延伸60s;4°C保持。
[0099]PCR2上、下游引物序列分别如SEQIDNO. 79、80所示。
[0100] 4、上机测序：采用IlluminaHiSeq2500PE101+8+101程序进行上机测序，测序实 验按照制造商提供的操作说明书（参见Illumina/Solexa官方公布cBot)进行上机测序操 作。
[0101] 5、免疫组库精准信息分析：
[0102] 1)基于已知接头序列确定7个随机碱基N的位置，7个随机碱基可以形成47种唯 一标签，将成对测序序列的测序序列1和测序序列2的唯一标签序列首尾相连，形成14bp 的一条索引，并且以这14bp作为的成对测序序列索引进行外部排序，以达到将来源于同一 个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的；
[0103] 2)对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据插入序列之间的汉 明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列 的汉明距离不超过3,以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；
[0104] 3)对于每个DNA模板扩增形成的系列重复片段中的测序序列的每一个测序碱基 进行互相比对，若某种碱基型在测序序列中的一致率达到80 %，则记新测序序列的这个碱 基为此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列，通过这种 方法矫正，可以有效去除测序和PCR中随机引入的错误，提尚检测的准确性；
[0105] 4)对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列；
[0106] 5)根据4)中得到的测序序列与頂GT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考 序列进行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计 定量；
[0107] 6)根据5)的结果进行序列结构分析，免疫组库表达谱分析、Biomarker分析。
[0108] 9.测序结果分析
[0109] 通过1例肺腺癌术后患者的血浆样品，基于以上方法步骤进行检测：
[0110] 9. 1患者TCR免疫多态性：见图2。结果说明，患者T淋巴细胞各V、J基因亚型分 布较均一，最高克隆占比〇. 60% -一T淋巴细胞组库多样性良好。
[0111] 9. 2患者BCR聚类分析结果（Lineage分析）：见图3。结果说明，Lineage基本呈 散在分布，预示B细胞组库多样性良好。
[0112] 综合性分析显示：患者术后总体免疫状态良好。
[0113] 以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进 行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方 案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法，包括以下步骤： (1) 血浆cfDNA提取； (2) BCR H链全长多重PCR扩增和TCR P链⑶R3多重PCR扩增； (3) 步骤（2)中两种扩增产物混合后再进行一次PCR扩增； (4) 高通量测序； (5) 免疫组库精