专利名称：一种血浆中利巴韦林含量的测定方法
技术领域：
本发明属体内药物分析和药物代谢动力学领域，特别是涉及血浆中利巴韦林含量的测定方法。
背景技术：
利巴韦林系广谱强效的抗病毒药物，为单磷酸次嘌呤核苷脱氢酶抑制剂，抑制MB转变为鸟苷酸，阻碍病毒核酸合成，阻止病毒复制和传播，从而达到抗病毒的作用。对多种RNA和DNA病毒均有明显的抑制作用，对HIV病毒也有较强的抑制作用。利巴韦林副作用少，不良反应发生率低，根据其药理作用，使用时要注意大剂量长期使用引起的白细胞减少、贫血、血清转氨酶和胆红素升高等现象，为保证临床用药安全有效，血浆中利巴韦林含 量的测定极其重要。到目前为止，有关利巴韦林含量的测定方法繁多，诸如紫外光谱法、高效液相色谱法(HPLC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、旋光法、比色法、高效毛细血管电泳法(HPCE)、线性扫描极谱法和高碘酸法等，较少见有LC-MS法测定利巴韦林含量的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的利巴韦林含量测定方法，该方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中利巴韦林的浓度，灵敏度较高，为保证药品质量控制及临床合理用药提供依据。本发明解决的技术问题通过以下技术方案来实现血浆中利巴韦林含量的测定方法包括下列步骤(I)血浆样品预处理a.含有利巴韦林的血浆，先加入内标溶液(6-甲基烟酸)混匀，再加入甲醇涡旋混匀后离心，取上层澄清溶液于35°C水浴中以氮气流吹干，用流动相复溶，涡旋后加入氯仿，涡旋静置后离心，吸取上层澄清溶液；b.流动相复溶后用LC-MS法检测；(2) LC-MS 检测方法色谱条件色谱柱SepaxHP-C18, dp 3 ii m, 2. I X 100mm,柱温30 °C,流动相30mmol/L醋酸铵水溶液(含0. 2%的甲酸)，流速0. 2ml/min ;质谱条件离子检测方式选择性离子检测(SIM)，离子极性正离子(Positive)，离子化方式气动辅助电喷雾离子化(ESI)。所述步骤(2)气助电喷雾离子源，采用正离子模式，传输电压为120V，干燥气流速为8L/min,雾化室压力为40psig,干燥气温度为350°C,用于定量分析的检测离子分别为m/z 267.0([M+Na]+，利巴韦林)和 m/z 138. I ([M+H]+，内标 6-甲基烟酸)。本发明特色之一是使用氯仿作为清除蛋白和内源性杂质的试剂，可以消除测定血浆中的内源性杂质干扰。本发明具有良好的回收率和精密度，简便快捷，不受制剂中其他成分的干扰，符合生物样品分析要求，可灵敏测定人体血浆中利巴韦林含量，适合用于利巴韦林药代动力学研究。本发明为确保血浆样品测定结果的有效可信准确，在每批血样测定时均随机加入并平行测定低、中、高3个浓度(20、200和1200i!g/L)的标准质控样品各2份，共测试了 12个分析批样品，每一分析批质控测定结果误差百分率均小于±15%，符合体内药物分析要求。
图I利巴韦林的质谱扫描图。图26-甲基烟酸的质谱扫描图。图3空白血样色谱图。
图4利巴韦林标准品色谱图。图5内标6-甲基烟酸对照品色谱图。
具体实施例方式人体血浆中利巴韦林含量测定方法，是在含药血浆中先加入内标溶液(6-甲基烟酸)混匀，再加入甲醇涡旋混匀后离心，取上清于35°C水浴中以氮气流吹干，用30mmol/L醋酸铵水溶液(含0.2%的甲酸)的流动相复溶，涡旋后加入氯仿，涡旋静置后离心，吸取上层澄清溶液，即可用LC-MS测定(色谱条件色谱柱=Sepax HP-C18, dp 3 u m, 2. I X 100mm,柱温30°C，流动相30mmol/L醋酸铵水溶液(含0. 2%的甲酸)，流速0. 2ml/min ;质谱条件离子检测方式选择性离子检测，离子极性正离子，离子化方式气动辅助电喷雾离子化)。测定结果标准曲线取空白血浆0.2ml，加适量利巴韦林标准溶液，配制成相当于利巴韦林血浆浓度为10、30、100、300、600、1000和1500 yg/L的溶液，按照测定步骤操作，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(权重系数W= 1/CXC)最小二乘法进行回归运算，求得回归方程为f =
0.008268+0. 1257 X C，r = 0. 9992，血浆中利巴韦林的最低定量限为10iig/L。本发明精密度取空白血浆加入适量的利巴韦林标准溶液，分别配成低、中、高3个浓度的样品(20、200和1200 yg/L)，按样品测定方法日内重复测定5次，日内RSD分别为5. 1%,3. I %和3.2%。同法配制的3个浓度样品连续测定3天，每一浓度重复测定5次，日间RSD分别为5. 5%、
5.5%和3. 3%。本发明提取回收率取空白血浆加入适量的利巴韦林标准溶液，分别配成低、中、高3个浓度的利巴韦林(20、200和1200ii g/L)，按样品测定方法重复测定5次，以实测值与理论值之比计算回收率分别为81. 4%、78. 0%和82. 3%，平均回收率为80. 6%。
权利要求
1.血浆中利巴韦林含量的测定方法，包括下列步骤 (1)血浆样品预处理 a.含利巴韦林成分的含药血浆,加入内标溶液￠-甲基烟酸)涡旋,再加入3-6倍血浆体积的甲醇涡旋混匀后，高速离心，取上层澄清溶液于30-70°C水浴中以氮气流吹干，用1-2倍血浆体积的流动相复溶；复溶液中加入等体积氯仿溶液，涡旋静置后高速离心，吸取上层澄清溶液待测。
b.上层澄清溶液用LC-MS法检测。
(2)LC-MS检测方法 色谱条件色谱柱Sepax HP-C18, dp 3 u m, 2. I X IOOmm,柱温30°C,流动相30mmol/L醋酸铵水溶液(含0. 2%的甲酸)，流速0. 2ml/min ;质谱条件离子检测方式选择性离子检测(SIM)，离子极性正离子(Positive)，离子化方式气动辅助电喷雾离子化(ESI)。
2.根据权利要求I所述的血浆中利巴韦林的测定方法，其特征在于所述步骤(2)气助电喷雾离子源，采用正离子模式，传输电压为120V，干燥气流速为8L/min，雾化室压力为40psig，干燥气温度为350°C，用于定量分析的检测离子分别为m/z 267. 0 ([M+Na]+，利巴韦林)和m/z 138. 1([M+H]+，内标6-甲基烟酸)。
3.根据权利要求I所述的血浆中利巴韦林的测定方法，其特征在于使用氯仿作为清除蛋白和内源性杂质的试剂，可以消除测定血浆中的内源性杂质干扰。
全文摘要
本发明涉及血浆中利巴韦林含量的测定方法，包括步骤(1)血浆样品的处理含有利巴韦林成分的含药血浆，加入内标溶液(6-甲基烟酸)和甲醇涡旋混匀后离心，取上层澄清溶液于35℃水浴中以氮气流吹干，以流动相复溶，涡旋后加入氯仿，涡旋静置后离心，吸取上层澄清溶液待测；(2)LC-MS法检测的色谱条件色谱柱Sepax HP-C18，dp 3μm，2.1×100mm，柱温30℃，流动相30mmol/L醋酸铵水溶液(含0.2％的甲酸)，流速0.2ml/min；质谱条件离子检测方式选择性离子检测(SIM)，离子极性正离子(Positive)，离子化方式气动辅助电喷雾离子化(ESI)，检测对象利巴韦林([M+Na]+，m/z 267.0)；6-甲基烟酸(内标，[M+H]+，m/z 138.1)。本发明适合用于血浆中利巴韦林的体内药代动力学研究。
文档编号G01N30/02GK102735764SQ20111008157
公开日2012年10月17日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者丁黎, 吴飞 申请人:上海张江中药现代制剂技术工程研究中心