专利名称：检测子宫内膜异位症血浆标志蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及子宫内膜异位症诊断领域，尤其是利用SELDI技术在体外检测子宫内膜异位症血浆标志蛋白质的方法。本发明还涉及由此获得的一系列可作为子宫内膜异位症的潜在生物标志物的血浆蛋白质及其在诊断子宫内膜异位症中的应用。
背景技术：
子宫内膜异位症是育龄妇女的多发病，引发多种临床症状。近年发病率呈明显上升趋势，已达10％-15％，占妇科手术的30％以上。子宫内膜异位症所引起的痛经、下腹痛和不孕严重影响妇女的健康和生活质量。尽管子宫内膜异位症是一种良性疾病，但其病变广泛、形态多样，极具侵袭和复发性，对脏器结构和功能的破坏与恶性肿瘤相当，故有“良性癌”之称。子宫内膜异位症的临床表现与疾病程度不成正比，因此缺乏有效的临床诊断方法。
郎等[14]发现子宫内膜异位症在位内膜在粘附、侵袭和血管形成等多方面有别于正常内膜。据此，我们提出了子宫内膜异位症发病的分子机制假说“在位内膜决定论”，即子宫内膜异位症患者在位内膜与正常内膜之间存在本质差别，子宫内膜异位症发病与否取决于患者在位内膜的特性，经血逆流只是实现这一由潜能到发病的桥梁。这一理论是我们作出本发明的理论基础。由于子宫内膜异位症患者在位内膜与正常内膜相比，其理化性质和生物学行为存在明显异常，这些异常就会反映到患者的体液中，使子宫内膜异位症患者的体液中的一些物质尤其是蛋白质的表达出现了质或量上的改变，即特异性的生物标志物。它对于疾病的早期诊断、治疗方案的选择、个体化和预见性治疗、临床预后评价和疾病发病机理的研究都具有重要意义。
对于子宫内膜异位症，尽管目前有部分应用于临床的标志物，如癌胚抗原125(CA125)、胎盘蛋白14(PP14)、子宫内膜抗体和白细胞介素6(IL-6)等，它们对于临床诊断和跟踪复发等方面具有一定的参考价值，但仍缺乏特异性(见下表1)。
表1.已发表的子宫内膜异位症血清诊断标志物及其敏感性和特异性
因此，寻找敏感、特异的子宫内膜异位症生物标志物是目前急需解决的问题。
SELDI-TOF-MS(表面增强激光解吸电离-飞行时间-质谱，Surface Bnhanced Laser Desorption Ionization-Time ofFlight-Mass Spectrometry)是最近发展起来的一种崭新的蛋白质组学研究方法。该技术通过经过特殊处理的固相支持物或层析表面，根据蛋白质的物理、化学性质不同，可以选择性地从样品中捕捉蛋白质配体，与芯片结合。经过孵育和洗脱后，进入质谱仪进行分析。在SELDI-TOF质谱仪中，用激光轰击与芯片结合并与基质混合的蛋白质后，蛋白质经过软离子化后，带有电荷并进入电场。由于不同质荷比的蛋白在电场中飞行时间不同，因此接收装置可以据此将蛋白质的质和量用位置不同、强弱不等的图谱表现出来并可以进一步分析。
SELDI技术适合临床蛋白质组学研究的要求，具有很高的灵敏度、特异性和重复性。另外从临床应用的角度来看，标本处理简单、分析方法简便迅速。SELDI技术通过把蛋白质结合在芯片上直接进行TOF-MS分析，避免了复杂的样品处理过程以及由此引起的蛋白质降解和丢失，样品无须纯化，可以直接检测人体的血液、尿液、脑脊液、胸腔积液、关节腔滑液等体液以及支气管灌洗液、细胞裂解液和各种分泌物。该方法还具有样品用量小、操作简便、高度灵敏、高通量的优点，可以检测到fmol(10-15mol)数量级的微量蛋白，可以同时获得样品中成千上万个蛋白质数据。该技术克服了传统双向电泳中的诸多问题如膜蛋白分离、强极性蛋白、低分子量和低丰度蛋白质难以检测等问题[1-3]。尤其是对于血浆中疾病相关的分泌型蛋白时，双向电泳就更加困难了。从传统的生物标志物研究的经验和已有的研究结果来看，存在于血浆中的疾病相关标志性分子多为小分子量的蛋白质或者多肽，分子量多在10000D以下，这正是传统双向电泳技术所无法覆盖的分子量范围。
同时SELDI技术产生的海量信息必须借助先进的数学模型和生物学信息技术进行分析。由于上述优点，SELDI技术一经推出就受到了临床研究工作者的高度青睐和关注，国内外学者已经利用这一技术对多种疾病进行诊断，如卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等恶性肿瘤，并开展了多项肿瘤标志物研究和发病机理研究，取得了可喜的成果(见下表2)。
表2.利用SELDI技术对多种肿瘤进行诊断的敏感性和特异性
SELDI有可能成为最先进入临床蛋白质组检测的技术。蛋白质芯片技术可以描绘出患者某些体液(血浆、尿液等)中所有蛋白质的表达情况，从而建立该疾病的指纹谱(finger print profile)，通过与正常人蛋白指纹谱的比较，可以较早地反映体内疾病的发生、发展状况。其优点在于对患者体内整体蛋白质表达异常的把握，而不受任何单个标志物的特异性、灵敏性的限制。挑选患者指纹谱中异常表达的多个蛋白质，依靠生物信息学和各种数学模型进行组合研究并建立诊断模型，可以作为临床诊断的指标，然后通过双盲法验证其准确性及特异性，此后再在不同类型、不同阶段的病变中进行比较性研究，以确定其临床意义，从而用于疾病的早期诊断、疗效监测及预后判断等，甚至可将其作为靶蛋白指导临床治疗。此外，也有报道蛋白质芯片技术用于多种疾病发病机制的研究，已发现了一系列新的癌症相关蛋白[9-13]。SELDI技术是目前蛋白质组技术中最有希望用于临床应用的技术之一。
发明内容
本发明采用SELDI蛋白芯片质谱技术，筛选出一种在子宫内膜异位症血浆中有特异性捕获蛋白质的芯片。对35例健康人和36例子宫内膜异位症患者的血浆标本进行了蛋白质质谱的监测，进行了成组资料平均数t检验。我们发现了21个在子宫内膜异位症组异常表达的蛋白质峰(P＜0.05)，这些蛋白质峰可以作为子宫内膜异位症血浆候选的生物标志物。可以进一步对这些蛋白质进行鉴定和功能研究，一方面可以发现这些蛋白质在子宫内膜异位症发病、发展及转归中的作用；另一方面则可以研究其在临床诊断、个体化治疗方案选择、病情监测及药物筛选中的意义。
由此，本发明在一方面提供了在体外检测子宫内膜异位症血浆标志蛋白质的方法，包括以下步骤获得患者的血浆标本；对该标本进行蛋白质质谱的检测；并将获得的结果与在正常人中获得的结果进行比较，结合生物信息学方法确定子宫内膜异位症血浆标志蛋白质。
在一个实施方案中，对蛋白质质谱的检测利用SELDI-TOF-MS技术进行。
本发明的研究结果显示子宫内膜异位症患者血浆中存在一组特异性标志性蛋白，它们之间相互关联构成了子宫内膜异位症血浆特殊的蛋白指纹图谱。利用这些标志物作为诊断依据，成功地建立了子宫内膜异位症血浆蛋白指纹诊断模型。本研究同时对71例血浆标本的血浆蛋白指纹数据输入人工神经网络系统进行数据分析。选择全部差异表达的蛋白质峰进行人工网络训练，得到了一个确定模型。经过内部的盲筛得到诊断子宫内膜异位症的敏感性为91.7％，特异性为82.9％。
由此，本发明在另一方面涉及可通过上述方法获得的子宫内膜异位症血浆标志蛋白质。在一个实施方案中，所述血浆标志蛋白质包括以下3个蛋白质质荷比峰(m/z)3956、6986和11710，其中质荷比为3956的蛋白质峰在子宫内膜异位症血浆中表达下调，而质荷比为11710和6986的蛋白质峰表达上调。
本发明的另一方面涉及用于检测可通过上述方法获得的子宫内膜异位症血浆标志蛋白质的相关检测试剂在制备诊断子宫内膜异位症的产品中的应用。基于本发明的教导，这样的相关检测试剂及其制备和应用对于本领域技术人员而言是常规的，其具体实例包括但不限于例如抗体、核酸探针等。在一个具体实施方案中，所述检测试剂为芯片的形式，包括但不限于例如物理芯片、化学芯片和生物芯片等。
本发明利用SELDI技术通过检测健康人及子宫内膜异位症患者血浆蛋白指纹图谱，建立基于人工神经网络的诊断模型，提高了子宫内膜异位症的诊断率。
图1显示由三个蛋白质峰构成的子宫内膜异位症诊断模型的图示(EM子宫内膜异位症；Control对照)。
图2显示质荷比分别为3956、11710和6986的蛋白质峰在子宫内膜异位症(EM)和对照(Control)健康妇女血浆中的表达。
具体实施例方式 现将结合具体实施例对本发明作进一步例示说明，应理解这些实施例仅用于举例说明目的，而绝非限制本发明的范围。
材料和方法 1.标本的采集和处理 手术中诊断明确的子宫内膜异位症患者术前血浆取自中国医学科学院北京协和医院，所有患者术前未服任何药物。与子宫内膜异位症对照的健康配对血浆取自北京协和医院血库。详细临床资料见下表。
表3.子宫内膜异位症患者和健康妇女的临床资料
将患者术前和健康志愿者外周血采集入含有0.1wt％肝素的试管中，4℃4000rpm离心8分钟。分装后，-80℃冰箱保存。
2.试剂和缓冲液 硫酸铜、尿素、乙酸钠、乙腈、三氟乙酸、CHAPS购自Sigma公司； SPA购自Ciphergen公司； Tris、HCL为国产分析纯； HPLC级水购自ALDRICH公司； U9缓冲液 9M尿素2％CHAPS 50mMTris-HCL pH9.0 3.仪器和软件 ProteinChip Biology System(PBS-II)、ProteinChip Software、Biomarker Pattern Software为Ciphergen公司产品； 芯片购自Ciphergen公司； 台式离心机为Sigma公司产品； 4.方法 1)血浆样品稀释和预处理 i.-80℃冰箱取出样品，室温融化，4℃10000rpm离心10分钟； ii.将血浆样品3μl与6μl U9缓冲液混合，振荡使混合均匀； iii.置冰浴30分钟，每5分钟用手轻弹一次使样品充分混匀； iv.9μl样品溶液内加入108μl结合缓冲液I，振荡混匀； 2)芯片处理 i.将蛋白芯片正确安装于Bioprocessor中； ii.在每孔中加入200μl结合缓冲液I，摇床孵育5分钟，重复一次； 3)上样和洗脱 i.每孔中加入100μl稀释血浆样品，摇床孵育1小时； ii.弃去血浆样品，每孔中加入200μl结合缓冲液I，摇床孵育5分钟； iii.弃去结合缓冲液I，重复上步骤2次； iv.弃去结合缓冲液I，每孔中加入200μl HPLC水，摇床孵育5分钟； v.弃去水，重复上步骤1次； vi.弃水，自然干燥； vii.每点上加0.5μl SPA，重复1次； viii.拆除Bioprocessor，取出芯片放入ProteinChip BiologySystem(PBS-II)中进行检测分析。
4)数据采集程序的优化 经过3次预实验，将ProteinChip Biology System(PBS-II)阅读芯片时的参数优化为如下设置 i.分子量检测范围2000-20000Dalton，最高分子量50000Dalton； ii.激光强度195； iii.检测器灵敏度8； iv.数据读取方式定量读取‘ v.芯片上每个点采集150次。
5)数据采集 ProteinChip Software3.0数据采集软件从ProteinChip BiologySystem(PBS-II)上采集数据，同时用加有肽分子量标准All-In-One校正阅读器。选取分子量为2-40kD区域读取血浆蛋白，该区涵盖了血浆中绝大部分可分辨的蛋白质，同时避免了基质分子和潜在化学物质污染。
选取质谱峰(trace view)的方式读取芯片上的蛋白数据。首先调整基线(base line)，然后才检测数据。
经过对SELDI的五种芯片实验后，初步确定其中的一种存在明显差异峰作为建立模型的芯片。
6)生物信息学分析 所有原始数据先用ProteinChip Software3.0进行校正。对每个图谱的蛋白质峰做相应的调整，以减少不同芯片、仪器状态等因素引起的误差。对于检测范围内的蛋白质峰应用Biomarker Wizard进行噪音过滤。选择信噪比＞8和在所有图谱中出现频率超过10％的蛋白质峰为有效蛋白质峰。得到初筛结果后，依照蛋白质峰做子宫内膜异位症与正常健康人两组数据比较t检验，得到P值。
7)诊断模型的建立和验证 用Biomarker Pattern Software对子宫内膜异位症与正常健康人两组相同的蛋白质峰做线性分类分析，经过进一步优化实验参数，确定最佳分类模型为诊断模型。该模型对去除噪音后的训练集建立分类决策树，在判断某一质荷比峰强度与另一临界点关系时，把数据收集分为两个节点，这两个节点再分别用新的质荷比峰作为判断，产生新的节点，如此反复直到节点不能再分为止，就建立了一个稳定的决策树。然后扩大样本量，用此诊断模型进行双盲分析其它子宫内膜异位症与正常健康人血浆中的SELDI质谱数据，根据分析结果评价该模型的准确性。
结果 1.初步筛选有意义的M/Z峰 35份正常血浆和36份子宫内膜异位症患者血浆的原始蛋白指纹图谱标准化后，在分子量为0-20000范围内共检测到77个蛋白质峰，在分子量为20000-300000范围内共检测到9个蛋白质峰，其中21个在子宫内膜异位症组和对照组之间有显著差异(P＜0.05)。下表列出了P＜0.01的蛋白质峰 表4.子宫内膜异位症组与对照组血浆差异表达的蛋白质峰(P＜0.01)Mean- Mean- M/Z pcontrol SD-control patient SD-patient 3956.318691 1.297E-0710.42976885 11.24571392 0.910646302 0.548924398 5476.696296 1.08544E-05 8.144608267 6.700228556 1.384642669 0.779190977 4477.889593 1.68367E-05 11.36578721 11.90443966 2.205652354 1.990182477 8600.533603 5.95809E-05 13.70805285 11.41386179 22.33842745 8.426494684 4964.089049 0.00024183 4.487536605 4.093167167 8.336781759 5.458662985 4091.32438 0.000455267 32.24191927 35.88618095 1.117948944 0.906219964 3932.962387 0.000684291 16.72941121.34021815 1.341534029 2.036975718 4282.333931 0.001120757 19.67193614 12.73847544 11.8250491 4.027617463 4133.25733 0.001803398 9.485161073 4.81239537 7.195225635 7.777258813 4818.539113 0.003561318 7.253981904 5.686316289 14.36115739 12.46482269 1006.525596 0.005966198 34.91292117 8.659768722 28.01279551 9.598838257 5633.019639 0.006221273 14.47722191 17.78311117 2.497683891 1.652315979 1072.201638 0.008299217 10.34544628 2.685473843 8.371831875 2.649032797 1135.116848 0.008642024 8.450502459 3.030595185 6.338910526 2.553574375 注M/Z为质荷比，Mean-control为对照组峰值，SD-control为对照组标准差；Mean-patient为子宫内膜异位症组峰值，SD-patient为子宫内膜异位症组标准差。
2.人工神经网络模型的建立 应用Biomarker Pattern Software对子宫内膜异位症与正常健康人两组相同的蛋白质峰做线性分类分析，经过进一步优化实验参数，结果显示子宫内膜异位症患者血浆中存在一组特异性标志性蛋白，它们之间相互关联构成了子宫内膜异位症血浆特殊的蛋白指纹图谱。
利用这些标志物作为诊断依据，成功地建立了子宫内膜异位症血浆蛋白指纹诊断模型，其包括为质荷比为3956m/z，6986m/z和11710m/z的蛋白质峰，其中在子宫内膜异位症血浆中质荷比为3956m/z的蛋白质峰表达下调，而质荷比为11710m/z和6986m/z的蛋白质峰则表达上调(见图2)。
图1显示由三个蛋白质峰构成的子宫内膜异位症诊断模型的图示。根据质荷比为3956的蛋白质峰的相对丰度将两组71例进行分类。结点1诊断为正常人，其中26例诊断正确，2例子宫内膜异位症患者漏诊；对其余43例病人再用质荷比为11710的蛋白质峰进一步分类。结点2诊断为子宫内膜异位症患者，其中25例诊断正确，2例正常人误诊；剩余16例用质荷比为6986的蛋白质峰分类，结点3诊断为正常人，其中5例诊断正确，2例子宫内膜异位症患者漏诊；结点4诊断为子宫内膜异位症患者，其中7例诊断正确，2例正常人误诊。
该模型对19例III-IV期子宫内膜异位症患者全部诊断正确，而对17例I-II期患者14例诊断正确，3例漏诊。总体而言，该模型诊断子宫内膜异位症诊断的敏感性为91.7％，特异性为82.9％，阳性预测值为84.6％，阴性预测值为90.6％。考虑到我们所选择的健康人并未排除子宫内膜异位症，而在育龄妇女中子宫内膜异位症发病率为5-15％，因此在健康对照组内有部分子宫内膜异位症患者，这就是该模型诊断特异性降低的主要原因。进一步扩大样本量，尽可能排除健康对照组中的子宫内膜异位症病例，将会使模型诊断的敏感性和特异性进一步提高。
表5.蛋白指纹质谱模型诊断的敏感性和特异性
3.盲法验证 用子宫内膜异位症、肌腺症、卵巢畸胎瘤、卵巢颗粒细胞瘤、子宫肌瘤及宫颈病变患者血浆进行盲法验证模型诊断的敏感性和特异性。结果表明8例子宫内膜异位症患者有7例被正确诊断，8例健康人及子宫肌瘤和卵巢良性肿瘤患者6例被排除。
上面已结合具体实施例和附图对本发明进行了例示说明，但本领域技术人员应理解，本发明的实施不限于以上详细描述的细节，不偏离本发明构思的多种变化和改动都在本发明范围之内。
参考文献
1.Merchant M，Weinberger SR.Recent advancements in surface-enhanced laserdesorption/ionization-time of flight mass spectrometry.Eletrophoresis，2000，21(6)1164-1177.
2.Issq HJ，Veenstra TD，Conrads TP，et al.The SELDI-TOF MS approach toproteomicsprotein profiling and biomarker identification.Biochem BiophysRes Commun，2002，292(3)587-592.
3.Weinberger SR，Morris TS，Pawlak M.Recent trends in protein biochiptechnology.Pharmacogenomics，2000，1(4)395-416.
4.Petricoin EF，Ardekani AM，Hitt BA，et al.Use of proteomic patterns in serumto identify ovarian cancer.Lancet，2002，359572-577.
5.Qu YS，Adam BL，Yutaka Y，et al.Boosted decision tree analysis ofsurface-enhanced laser desorption/ionization mass spectral serum profilesdiscriminates prostate cancer from noncancer patients.ClinChem，2002，48(10)1835-1843.
6.Vlahou A，Schellhammer PF，Mendrinos S，et al.Development of a novelproteomic approach for the detection of transitional cell carcinoma of thebladder in urin.Am J Path，2001，1581491-1502.
7.Terence CWP，Tai TY，Christine YIP，et al.Application of the SELDIProteinChip Biomarker System to the discovery of biological biomarkersassociated with hepatocellucar carcinoma.Reported at AACR 2002.
8.Xiao XY，Tang Y，Wei XP，et al.A preliminary analysis of non-small cell lungcancer biomarkers in serum.Biomed Environ Sci，2003，16(2)140-148.
9.Li J，Zhang Z，Rosenzweig J，et al.Proteomics and bioinformatics approachesfor identification of serum biomarkers to detect breast cancer.ClinChem，2002，48(8)1296-1304.
10.Adam B L，Qu Y，Davis J W，et al.Serum protein fingerprinting coupled witha pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from benignprostate hyperplasia and healthy men.Cancer Res，2002，62(13)3609-3614.
11.Banez L L，Prasanna P，Sun L，et al.Diagnostic potential of serum proteomicpatterns in prostate cancer.J Urol，2003，170(2P t1)442-446.12.CarterD，Douglass J F，Cornellison C D，et al.Purification and characterizationof the mammaglobin lipophilin B complex，a promising diagnostic marker forbreast cancer.Biochemistry，2002，41(21)6714-6722.
13.Wellmann A，Wollscheid V，Lu H，et al.Analysis of microdissected prostatetissue with protein chip arrays-a way to new insights into carcinogenesisand to diagnostic tools.Int J Mol Med，2002，9(4)341-347.
14.郎景和主编.子宫内膜异位症的基础与临床研究.第1版。北京中国协和医科大学出版社，2003.35-50.
15.J Bosens.0bstet Gynecol Clin N Am 2003，3095-114.
权利要求
1.在体外检测子宫内膜异位症血浆标志蛋白质的方法，包括以下步骤获得患者的血浆标本；对该标本进行蛋白质质谱的检测；并将获得的结果与在正常人中获得的结果进行比较，结合生物信息学方法确定子宫内膜异位症血浆标志蛋白质。
2.权利要求1的方法，其中对蛋白质质谱的检测利用SELDI-TOF-MS技术进行。
3.可通过权利要求1或2的方法获得的子宫内膜异位症血浆标志蛋白质。
4.权利要求3的血浆标志蛋白质，其包括以下3个蛋白质质荷比峰3956m/z，6986m/z和11710m/z。
5.用于检测权利要求3或4的血浆标志蛋白质的相关检测试剂在制备诊断子宫内膜异位症的产品中的应用。
6.权利要求5的应用，其中所述检测试剂选自抗体和核酸探针。
7.权利要求5的应用，其中所述检测试剂为芯片的形式。
全文摘要
本发明提供了在体外检测子宫内膜异位症血浆标志蛋白质的方法，包括以下步骤获得患者的血浆标本；对该标本进行蛋白质质谱的检测，特别是利用SELDI-TOF-MS技术进行检测；并将获得的结果与在正常人中获得的结果进行比较，结合生物信息学方法确定子宫内膜异位症血浆标志蛋白质。本发明还涉及可通过上述方法获得的子宫内膜异位症血浆标志蛋白质及其相关检测试剂在制备诊断子宫内膜异位症的产品中的应用。
文档编号G01N33/68GK101210929SQ200610156138
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月29日 优先权日2006年12月29日
发明者刘海元, 郎景和 申请人:中国医学科学院北京协和医院