血浆肾素的质谱分析的制作方法
【专利摘要】提供了利用质谱法测量血浆样本中肾素活性的方法。该方法总体包括电离来自样本的纯化的血管紧张素1和检测生成的血管紧张素1离子的量。然后将所检测的血管紧张素1离子的量关联于样本中生成的血管紧张素1的量，该血管紧张素1的量进而被关联于样本中的肾素活性。
【专利说明】血浆肾素的质谱分析
[0001]本申请是申请日为2009年8月7日、申请号为200980130208.2、题为“血浆肾素的质谱分析”的专利申请的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及肾素活性的测量。在一个具体方面，本发明涉及通过HPLC-质谱法测量血浆肾素活性的方法。
[0003]发明背景
[0004]下列发明背景的描述只是提供用来辅助理解本发明，并非承认描述或构成本发明的现有技术。
[0005]如Fredline等Clin.Chem.45:659-664(1999)所述，肾素是通过肾小球旁细胞分泌到血液中的蛋白水解酶。肾素作用于血管紧张素原，生成被称作血管紧张素I(Angl)的十肽。Angl被血管紧张素转换酶进一步切割，形成被称作血管紧张素2 (Ang2)的八肽。Ang2刺激细胞生长、钠的肾小管运输和醛固酮释放。Ang2是人最有效的血管加压剂之一，并在血压调控中起重要作用。Ang2由于其循环浓度非常低和半衰期极短而难于直接测量；比Ang2更稳定的Angl为测量肾素-血管紧张素系统的状态提供了更好的分析物。由Angl的生成速率确定“血浆肾素活性”(PRA)被临床用于高血压的诊断和控制。
[0006]确定PRA的经典方法是放射免疫测定(RIA)，参见Sealey，Clin.Chem.37:1811-1819(1991) ;Shionoiri 等，Horm Res.37:171-175 (1992)。典型的放射免疫测定通过在试管中同时制备一系列标准和未知的混合物而进行，各混合物包含相同浓度的标记抗原和特异性抗体。适当的反应时间后，通过多种技术中之一将标记抗原的抗体结合(B)部分与游离(F)部分分离。将标准品的B/F比作为未标记抗原浓度的函数作图(标准曲线)，且通过将观测到的B/F比与标准曲线进行比较来确定未知的抗原浓度。放射免疫测定法基于竞争性结合原理，且所用的抗体可进行与其它血浆蛋白如内源血管紧张素的非特异性结合。这种潜在的交叉反应性可引起PRA的过高评价。另一个方法是在用RIA定量前利用HPLC从其它血管紧张素中分离Angl (参见下列实例:Meng 等,J.Am.Soc.Nephrol.6:1209-1215(1995) ；Meng 等,J.Chromatogr.21, 614(1):19-25(1993) ；Kohara 等，P印tidesl2:1135-1141 (1991))。已利用紫外光、荧光和质谱检测发展了用于定量Angl的这些HPLC法(参见下列实例=Klickstein等，AnalBiocheml20:146-150(1982) ；Miyazaki 等,JChromatogr.490:43-51(1989)和 Fredline等，Clin.Chem.45:659-664(1999))。
[0007]例如，Fredline等描述了利用HPLC-电喷雾-串联质谱法进行血浆肾素活性的测量。在进行该测量中，Fredline等在水敏性酶抑制剂(即，苯甲基磺酰氟(PMSF))存在下温育血浆样本，并通过观测具有(m/z)649的前体离子的碰撞诱导解离来测量温育期间生成的血管紧张素I量。
[0008]发明概述
[0009]本发明提供了通过质谱法测量样本中血管紧张素I的量和测量样本中血浆肾素活性的方法，所述质谱法包括串联质谱法。
[0010]一方面，提供测量样本中血管紧张素I的量的方法。该方法可包括:(a)电离样本中的血管紧张素1，产生一种或更多种可由质谱法检测的离子；(b)通过质谱法检测血管紧张素I尚子(一种或更多种)的量，其中该尚子选自质/荷比为433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5和1297±0.5的离子；以及(c)利用所检测的血管紧张素I离子(一种或更多种)的量来测量样本中血管紧张素I的量。在一些实施方式中，该方法的定量极限是小于或等于0.1ng/mL ;如小于或等于0.05ng/mL ;如约0.03ng/mL。在进一步的实施方式中，该方法包括通过高效液相色谱(HPLC)从样本纯化血管紧张素I。在一些实施方式中，该方法进一步包括用固相萃取柱纯化样本中的血管紧张素I。在其它实施方式中，通过与内标的比较，将血管紧张素I离子(一种或更多种)的量关联于样本中血管紧张素I的量。在一些实施方式中，降解标准品可用于确定血管紧张素I生成后的降解程度。
[0011]另一方面，提供测量样本中血管紧张素I的量的方法。该方法可包括:(a)电离来自样本的血管紧张素1，产生一种或更多种离子；以及(b)通过质谱法测量至少一种所述尚子的量，其中所述尚子选自具有下列质/荷比的尚子:433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5和1297±0.5;以及其中所测的血管紧张素1离子(一种或更多种)的量提供样本中血管紧张素I的量的度量。在一些实施方式中，降解标准品可用于确定血管紧张素I生成后的降解程度。
[0012]另一方面，提供测量样本中血管紧张素I的量的方法。该方法可包括:(a)在适于样本中的肾素生成血管紧张素I的条件下，温育与水稳定性蛋白酶抑制剂预混合的样本，该水稳定性蛋白酶抑制剂对肾素无效；(b)通过液相色谱从样本中纯化血管紧张素I ;(c)电离纯化的血管紧张素1，产生一种或更多种可由质谱检测的离子；(d)通过质谱检测一种或更多种血管紧张素离子的量；以及(e)利用所测的离子(一种或更多种)量来测量样本中血管紧张素I的量。在一些实施方式中，该方法的定量极限是小于或等于0.1ng/mL ;如小于或等于0.05ng/mL ;如约0.03ng/mL。在进一步的实施方式中，由质谱生成的离子选自选自具有下列质/荷比的离子:433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5和1297±0.5。在相关的实施方式中，离子包括具有质/荷比433.0±0.5的前体离子和一种或更多种碎片离子，该碎片离子选自具有质/荷比619.4±0.5和647.4±0.5的离子。在其它实施方式中，通过与内标的比较，将血管紧张素I离子(一种或更多种)的量关联于检测样本中血管紧张素I的量。在其它优选实施方式中，该方法进一步包括用固相萃取柱纯化样本中的血管紧张素I。在其它优选实施方式中，水稳定性蛋白酶抑制剂是氨乙基苄基磺酰氟(aminoethy lbenzy Isulfony I fluoride)。在一些实施方式中，降解标准品可用于确定血管紧张素I生成后的降解程度。
[0013]另一方面，提供测量样本中血管紧张素I的量的方法。该方法可包括:(a)在适于样本中的肾素生成血管紧张素I的条件下温育样本；(b)通过固相萃取从所述样本中纯化血管紧张素I ;(c)步骤(b)后，通过联机处理的液相色谱进一步纯化血管紧张素I ;(d)电离步骤(C)纯化的血管紧张素1，产生一种或更多种可由质谱法检测的离子；以及(e)通过质谱检测一种或更多种血管紧张素I离子的量，(f)利用所测的离子(一种或更多种)量来测量样本中血管紧张素I的量。在一些优选实施方式中，液相色谱是高效液相色谱(HPLC)。在其它实施方式中，该方法的定量极限是小于或等于0.1ng/mL ;如小于或等于0.05ng/mL ；如约0.03ng/mL。在进一步的实施方式中，该方法包括生成离子，该离子包括选自具有下列质/荷比的尚子的一种或更多种尚子:433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5和1297 + 0.50在相关的实施方式中，该方法包括生成血管紧张素I的前体离子，其中前体离子中至少一种具有质/荷比433.0±0.5。在相关的优选实施方式中，该方法可包括生成血管紧张素I前体离子的一种或更多种碎片离子，其中碎片离子中至少一种具有质/荷比619.4±0.5或647.4±0.5。在进一步的实施方式中，温育在对肾素无效的水稳定性蛋白酶抑制剂的存在下发生。在某些优选实施方式中，水稳定性蛋白酶抑制剂是氨乙基苄基磺酰氟。在一些实施方式中，通过与内标的比较，将血管紧张素I离子(一种或更多种)量关联于检测样本中血管紧张素I的量。在一些实施方式中，降解标准品可用于确定血管紧张素I生成后的降解程度。
[0014]另一方面，提供测量样本中肾素活性的方法。该方法可包括:(a)在适于样本中的肾素生成血管紧张素I的条件下温育样本；(b)通过固相萃取从样本中纯化血管紧张素I ;(C)通过联机处理的液相色谱进一步纯化血管紧张素I ;(d)电离纯化的血管紧张素1，产生一种或更多种可由质谱法检测的离子；(e)通过质谱检测一种或更多种血管紧张素I离子的量；(f)利用所测的离子(一种或更多种)量来测量样本中样本中血管紧张素I的量；以及(g)利用样本中血管紧张素I的量来计算样本中的肾素活性。在一些优选实施方式中，液相色谱是高效液相色谱(HPLC)。在另一个实施方式中，该方法的定量极限是小于或等于0.1ng/mL ;如小于或等于0.05ng/mL ;如约0.03ng/mL。在进一步的实施方式中，该方法包括:生成血管紧张素I的前体离子，其中前体离子中至少一种具有质/荷比433.0±0.5，和生成血管紧张素I前体离子的一种或更多种碎片离子，该碎片离子选自具有质/荷比619.4±0.5或647.4±0.5的离子。在一些实施方式中，温育在水稳定性蛋白酶抑制剂的存在下发生。在优选的相关实施方式中，水稳定性蛋白酶抑制剂是氨乙基苄基磺酰氟。在一些实施方式中，通过与内标的比较，将血管紧张素I离子(一种或更多种)量关联于检测样本中血管紧张素I的量。在一些实施方式中，降解标准品可用于确定血管紧张素I生成后的降解程度。
[0015]另一方面，提供测量样本中肾素活性的方法。该方法包括:(a)在适于样本中的肾素生成血管紧张素I的条件下，温育与水稳定性蛋白酶抑制剂预混合的样本，该水稳定性蛋白酶抑制剂对肾素无效；(b)通过液相色谱纯化血管紧张素I ;(c)电离纯化的血管紧张素1，产生一种或更多种可由质谱法检测的离子；(d)通过质谱检测一种或更多种血管紧张素I离子的量；(e)利用所测的离子(一种或更多种)量来测量所述样本中血管紧张素I的量；以及(f)利用样本中血管紧张素I的量来计算样本中的肾素活性。在一些优选实施方式中，液相色谱是高效液相色谱(HPLC)。在另一个实施方式中，该方法的定量极限是小于或等于0.1ng/mL ;如小于或等于0.05ng/mL ;如约0.03ng/mL。在进一步的实施方式中，该方法包括生成血管紧张素I的前体离子，其中前体离子中至少一种具有质/荷比433.0±0.5，和生成血管紧张素I前体离子的一种或更多种碎片离子，该碎片离子选自具有质/荷比619.4±0.5或647.4±0.5的离子。在一些优选实施方式中，步骤(b)包括用固相萃取柱从样本中纯化血管紧张素I。在进一步的实施方式中，水稳定性蛋白酶抑制剂是氨乙基苄基磺酰氟。在一些实施方式中，降解标准品可用于确定血管紧张素I生成后的降解程度。
[0016]另一方面，提供测量样本中肾素活性的方法。该方法包括:(a)在适于样本中的肾素生成血管紧张素I的条件下温育样本；(b)通过液相色谱纯化样本中的血管紧张素I;(C)电离纯化的血管紧张素1，产生一种或更多种可由质谱法检测的离子；(d)通过质谱检测血管紧张素I离子(一种或更多种)的量，其中该离子(一种或更多种)选自具有下列质 / 荷比的离子:433.0±0.5,619.4±0.5,647.4±0.5 和 1297±0.5 ； (e)利用所检测的离子(一种或更多种)的量来测量所述样本中血管紧张素I的量；以及(f)利用样本中血管紧张素I的量来计算样本中的肾素活性。在一些实施方式中，该方法的定量极限是小于或等于0.1ng/mL ;如小于或等于0.05ng/mL ;如约0.03ng/mL。在一些实施方式中，温育在水稳定性蛋白酶抑制剂的存在下发生。在优选的相关实施方式中，水稳定性蛋白酶抑制剂是氨乙基苄基磺酰氟。在一些实施方式中，液相色谱是高效液相色谱(HPLC)。在一些实施方式中，该方法的步骤(b)进一步包括用固相萃取柱纯化血管紧张素I。在进一步的实施方式中，通过与内标的比较，将血管紧张素I离子(一种或更多种)的量关联于检测样本中血管紧张素I的量。在一些实施方式中，降解标准品可用于确定血管紧张素I生成后的降解程度。
[0017]在一些实施方式中，如果温育约3小时后PRA低于0.65ng血管紧张素/mL/hr,则可将检测样本温育较长一段时间(例如，直至约18小时)，从而建立PRA生成方案。
[0018]优选实施方式单独地利用高效液相色谱(HPLC)、或利用高效液相色谱(HPLC)结合一种或更多种纯化方法来纯化样本中的血管紧张素1，所述一种或更多种纯化方法例如但不限于固相萃取技术或蛋白质沉淀。
[0019]在本文所公开方法的某些优选实施方式中，在正离子模式下进行质谱法。或者，可在负离子模式下进行质谱法。在特别优选的实施方式中，应用正离子和负离子模式二者测量血管紧张素I。在某些优选实施方式中，利用电喷雾离子化(ESI)或基质辅助激光解吸离子化(MALDI)在正或负模式下测量血管紧张素I。
[0020]在优选实施方式中，质谱仪中可检测的血管紧张素I离子选自具有下列质/荷比(m/z)的离子:1297±0.5、756±0.5、649±0.5、647.4±0.5、619.4±0.5、534±0.5、506±0.5,433.0±0.5、343±0.5、255±0.5和110±0.5。在特别优选的实施方式中，前体离子具有质/荷比433.0±0.5，并且碎片离子具有质/荷比619.4±0.5或647.4±0.5。
[0021]在优选实施方式中，将可单独检测的同位素标记的血管紧张素I加入样本作为内标。在这些实施方式中，将样本中存在的内源血管紧张素I和内标的全部或部分电离，生成大量质谱仪中可检测的离子，并且通过质谱法检测各自生成的一种或更多种离子。在相关的实施方式中，同位素标记的血管紧张素I可包括13C和15N同位素标记的缬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸脯氨酸亚基或其组合。在进一步的优选实施方式中，同位素标记的血管紧张素I具有缬氨酸亚基，其中碳原子被13C同位素取代且氮原子被15N同位素取代，导致相对于天然血管紧张素I质量增加6Da。在相关的优选实施方式中，同位素标记的血管紧张素I具有缬氨酸和异亮氨酸亚基，其中碳原子被13C同位素取代且氮原子被15N同位素取代。这种同位素标记的血管紧张素I的质量比天然血管紧张素I在标称下高13Da0
[0022]在优选实施方式中，通过与内标的比较，将血管紧张素I离子(一种或更多种)的存在和/或量关联于检测样本中血管紧张素I的存在和/或量。
[0023]在本文所公开方面的某些优选实施方式中，血管紧张素I的定量极限(limitof quantitation, LOQ)小于或等于 0.1ng/mL ;如小于或等于 0.05ng/mL ;如约 0.03ng/mL;以及血管紧张素I的定量上限(upper limit of quantitation, ULOQ)大于或等于100,OOOfmol/mLo
[0024]另一方面，提供用于血管紧张素I定量分析的试剂盒。试剂盒包含磷酸缓冲盐水溶液中的氨乙基苄基磺酰氟(AEBSF)，其中所述磷酸缓冲盐水溶液中的AEBSF以对至少一次分析足够的量存在。试剂盒可另外包含对至少一次分析足够量的内标和马来酸。
[0025]如本文所用，除非另外表述，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the) ”包括复数指代物。因此，例如，对“一蛋白质(a protein)”的提及包括多数蛋白质分子。
[0026]如本文所用，术语“纯化”或“提纯”并非指从样本中去除目标分析物(一种或更多种)之外的所有物质。取而代之，纯化是指相对于样本中可干扰目标分析物检测的其它组分富集一种或更多种目标分析物的量的过程。本文中可通过多种方法纯化样本，以便允许去除一种或更多种干扰物质。例如，会干扰所选血管紧张素I母离子和子离子的质谱检测的一种或更多种物质。
[0027]如本文所用，术语“检测样本”指可包含血管紧张素的任何样本。如本文所用，术语“体液”的意思是能从个体身体分离的任何液体。体液的实例包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、眼泪、汗液及类似物。
[0028]如本文所用，术语“色谱法”是指由液体或气体运载的化学混合物分离为组分的过程，这是由于化学实体在固定液相或固相周围流动或流过固定液相或固相时的差别分布而引起的。
[0029]如本文所用，术语“液相色谱法”或“LC”意为这样的过程:在流体均匀地渗滤通过细碎物的柱或渗滤通过毛细管通道时，流体溶液的一种或更多种组分的选择性延迟。延迟由该流体相对于固定相(一种或更多种)运动时混合物组分在一种或更多种固定相与本体流体(bulkfluid)(即，流动相)之间的分布而引起。利用“液相色谱法”的分离技术的实例包括反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)和湍流液相色谱法(TFLC)(有时被称为高湍流液相色谱法(HTLC)或高通量液相色谱法)。在一些实施方式中，可结合LC柱应用SPE柱。例如，可用TFLC萃取柱纯化样本，然后用HPLC分析柱另外纯化。
[0030]如本文所用，术语“高效液相色谱法”或“HPLC” (有时被称为“高压液相色谱法”)指这样的液相色谱法:其中通过使流动相在压力下穿过固定相来提高分离的程度，所述固定相一般是紧密装填的柱。
[0031]如本文所用，术语“湍流液相色谱法”或“TFLC”(有时被称为高湍流液相色谱法或高通量液相色谱法)指这样的色谱形式:将所分析的物质湍流穿过柱填料用作实现分离的基础。TFLC已被用于在质谱分析前制备包含两种未命名药物的样本。参见，例如，Zimmer 等，JChromatogr A854:23-35 (1999);同样参见美国专利号 5，968，367,5, 919，368、5，795，469和5，772，874，其进一步说明了 TFLC。本领域技术人员理解“湍流”。当流体缓慢和平稳流动时，该流动被称为“层流”。例如，以低速率穿过HPLC柱运动的流体为层流。在层流中，流体颗粒的运动是有序的，颗粒总体成直线运动。在较快的速度下，水的惯性克服流体摩擦力，湍流产生。没有触及不规则界限的流体“超过”被摩擦减慢或被不均匀的表面偏斜的流体。当流体湍流时，其以涡流和旋流(或漩涡)流动，具有比流体层流时更多的“拖曳”。许多参考文献可用于辅助确定何时流体流是层流或湍流(例如，Turbulent Analysis!Measurement and Prediction, P.S.Bernard & J.M.Wallace, JohnWiley & Sons, Inc., (2000):An Introduction to Turbulent Flow,.Tean Mathieu&JulianScott, Cambridge University Press (2001))。
[0032]如本文所用，术语“固相萃取”或“SPE”指这样的方法:其中由于溶于或悬浮于溶液(即，流动相)的组分对溶液所经过的固体或经过周围的固体(即，固相)的亲和力，化学混合物被分离为组分。在一些实例中，随流动相经过固相或经过固相周围，不需要的流动相组分可被固相保留，造成流动相中分析物的纯化。在其它实例中，分析物可被固相保留，使不需要的流动相组分经过固相或固相周围。在这些实例中，然后利用第二流动相将被保留的分析物从固相洗脱，用于进一步的处理或分析。SPE——包括将湍流液相色谱(TFLC)柱用作萃取柱，可通过单一或混合模式机制运行。混合模式机制在同一柱中应用离子交换和疏水保留；例如，混合模式SPE柱的固相可显示强阴离子交换和疏水保留；或可显示为柱显示强阳离子交换和疏水保留。 [0033]如本文所用，术语“分析柱”指这样的色谱柱:其具有足够的色谱板，从而实现从柱洗脱的样本中物质的分离，其足以确定分析物的存在或含量。通常将这样的柱与“萃取柱”区分，萃取柱的主要目的是从非保留物质中分离或萃取保留物质，以便获得纯化的样本用于进一步分析。在优选实施方式中，分析柱包含直径约4iim的颗粒。
[0034]如本文所用，术语“联机(on-line) ”或“在线(in-line) ”例如用于“联机自动方式”或“联机萃取”时，是指不需要操作员干预而进行的程序。例如，通过阀门和连接器管道的仔细选择，可按需将固相萃取柱和液相色谱柱连接，以使物质从一个柱被送至下一个柱，而不需要任何手动步骤。在优选实施方式中，通过预设程序的计算机控制阀门和管道的选择，从而进行必要的步骤。最优选地，将色谱系统也以这种联机方式连接于检测系统，例如，MS系统。因此，操作员可在自动取样器中放置多孔或多管样本盘(tray)，并在计算机控制下进行剩余的操作，导致全部所选样本的纯化和分析。相反，本文所用的术语“脱机(off-line) ”指需要操作员手动干预的程序。因此，如果样本经历沉淀且上清液随后被手动加样到自动加样器中，则沉淀和加样步骤与随后的步骤脱机。在本方法的多个实施方式中，可以以联机自动方式进行一个或更多个步骤。
[0035]如本文所用，术语“质谱法”或“MS”指通过其质量识别化合物的分析技术。MS指基于其质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。MS技术一般包括:(1)电离化合物，形成带电化合物；和(2)测量带电化合物的分子量，并计算质荷比。可通过任何适当的方法电离和检测化合物。“质谱仪”一般包含电离器和离子检测器。总体上，电离一种或更多种目标分子，随后将离子引入质谱装置，此处由于磁场和电场的组合，离子沿取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的空间路径行进。参见:例如，美国专利号6，204，500，标题为 “Mass Spectrometry From Surfaces，，；6，107，623,标题为 “Methods and Apparatusfor Tandem Mass Spectrometry，，；6, 268，144,标题为 “DNA Diagnostics Based On MassSpectrometry” ；6, 124，137,标题为 “Surface-Enhanced Photolabile Attachment AndRelease For Desorption And Detection Of Analytes，，;Wright 等，Prostate Cancer andProstatic Diseases2:264-76 (1999)；和 Merchant and Weinberger, Electrophoresis21:1164-67(2000)。
[0036]如本文所用，术语“正离子模式下操作”指那些生成和检测正离子的质谱法。如本文所用，术语“负离子模式下操作”指那些生成和检测负离子的质谱法。
[0037]如本文所用，术语“离子化”或“电离”指这样的过程:生成具有等于一个或更多个电子单位的净电荷的分析物离子。负离子是具有一个或更多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或更多个电子单位的净正电荷的离子。
[0038]如本文所用，术语“电子电离”或“EI”指这样的方法:其中气相或蒸气相中的目标分析物与电子流相互作用。电子与分析物的碰撞产生分析物离子，该离子然后可经受质谱技术。
[0039]如本文所用，术语“化学电离”或“Cl”指这样的方法:其中反应气(例如，氨气)经受电子碰撞，且通过反应气与分析物分子的相互作用生成分析物离子。
[0040]如本文所用，术语“快原子轰击(fast atom bombardment) ”或“FAB”指这样的方法:其中高能原子束(通常为Xe或Ar)碰撞非挥发性样本，解吸和电离样本中包含的分子。检测样本被溶于粘性液体基质如甘油、硫代甘油、间硝基节醇(m-nitrobenzyl alcohol)、18-冠-6冠醚(18-crown_6 crown ether)、2_硝基苯基辛醚、环丁讽、二乙醇胺和三乙醇胺中。对化合物或样本的适当基质的选择是经验法。
[0041 ] 如本文所用，术语“基质辅助激光解吸离子化”或“MALDI ”指这样的方法:其中将非挥发性样本暴露于激光辐射，其通过多种离子化途径使样本中的分析物解吸和电离，该离子化途径包括光致电离、加质子作用、去质子作用和集群衰变(cluster decay)。对于MALDI，将样本与能量吸收基质混合，这促进分析物分子的解吸。
[0042]如本文所用，术语“表面增强激光解析离子化”或“SELDI”指另一种方法，其中将非挥发性样本暴露于激光辐射，其通过多种离子化途径使样本中的分析物解吸和电离，该途径包括光致电离、加质子作用、去质子作用和集群衰变。对于SELDI，一般将样本结合在优先保留一种或更多种目标分析物的表面。如MALDI，该方法也可利用能量吸收材料促进离子化。
[0043]如本文所用，术语“电喷雾离子化”或“ESI”指这样的方法:其中溶液沿短长度的毛细管通过，对其末端应用高的正电压或负电压。到达管末端的溶液被蒸发(雾化)为溶剂蒸气中的极小溶液液滴的喷射流或喷雾。该液滴雾流经蒸发室，略微加热该蒸发室以防止冷凝和蒸发溶剂。随液滴变小，表面电荷密度增加，直至这样的时候:相同电荷间的天然排斥造成离子和中性分子被释放。
[0044]如本文所用，术语“大气压化学电离”或“APCI”指与ESI相似的质谱法；但是，APCI通过大气压下发生在血浆中的离子-分子反应生成离子。通过喷雾毛细管和反电极间的放电维持血浆。然后一般通过一组差异抽提截取过程的应用将离子提取到质量分析仪中。可利用干燥并预加热的N2气的逆流来改进溶剂的去除。APCI中的气相离子化可比ESI更有效用于分析较小极性的种类。
[0045]本文所用的术语“大气压光致电离(AtmosphericPressure Photoionization)”或“APPI”指这样的质谱形式:分子M的光致电离机制是光子吸收和电子喷射形成分子离子M+。由于光子能量一般刚刚高于电离势，分子离子较不易被分解。在许多情况下，有可能不需要色谱法而分析样本，从而节省了大量时间和成本。在水蒸汽或质子溶剂存在下，分子离子可提取H形成MH+。如果M具有高质子亲和力，这种情况趋于发生。其不影响定量准确度，因为M+和MH+的总合是恒定的。质子溶剂中的药物化合物通常被观测为MH+,而非极性化合物如萘或睾酮通常形成M+。参见:例如，Robb等，Atmosphericpressure photoionization:An ionization method for liquid chromatography-massspectrometry.Anal.Chem.72(15):3653-59(2000)。
[0046]如本文所用，术语“电感耦合等离子体”或“ICP”指这样的方法:其中样本与部分电离的气体在足够高的温度下相互作用，以使大部分元素雾化和电离。
[0047]如本文所用，术语“场解吸”指这样的方法:其中将非挥发性检测样本放置在电离表面上，且利用强电场生成分析物离子。
[0048]如本文所用，术语“解吸”指分析物从表面的去除和/或分析物进入气相。
[0049]如本文所用，术语“定量极限”、“定量限值”或“L0Q”指测量在数量上有意义的点。在该LOQ的分析物反应是可识别的、离散的和可重现的，具有20%的精确度和80%至120%的准确度。定量上限指分析物反应的上部可计量线性范围。
[0050]如本文所用，术语“检测极限”或“L0D”是测量值大于其相关的不确定性的点。任意地将LOD限定为零浓度的3个标准偏差(SD)。
[0051]关于定量测量——不包括离子质量测量，本文所用的术语“约”指所述值加或减10%。质谱装置在确定给定分析物的质量方面可略微变化。在离子质量或离子质/荷比的上下文中，术语“约”指+/-0.5原子质量单位。
[0052]上述发明概述不具有限制性，根据以下发明详述和根据权利要求书，本发明的其它特征和优势将是显而易见的。
[0053]附图简述
[0054]图1显示Angl的碰撞诱导解离全扫描谱(m / z=433.0) (Angl的碰撞辅助解离谱)。
[0055]图2显示内标的碰撞诱导解离全扫描谱(m / z=434.8)(内标(DR [V15N, 13C]YIHPFHL的碰撞辅助解离谱)。
[0056]图3显示Angl质谱检测的示例性校准曲线。
[0057]图4A、B和C分别显示对于低浓度校准品,Angl (m/z=433.0±0.5)、内标(m/z=434.8±0.5)和降解标准品(m/z=437.3±0.5)的示例性质量色谱图。
[0058]图5A、B和C分别显示对于显示0.1ng/mL/hr的患者样本，Angl (m/z=433.0±0.5)、内标(m/z=434.8±0.5)和降解标准品(m/z=437.3±0.5)的示例性质量色谱图。
[0059]发明详述
[0060]描述了用于测量样本中血管紧张素I的量的方法。更具体地，描述了检测和定量与血浆样本中肾素活性有关的血管紧张素I的方法。该方法利用液相色谱(LC)，最优选HPLC，来进行所选分析物的纯化，并将该纯化与独特的质谱(MS)法结合，从而提供检测和定量检测样本中血管紧张素I的高通量分析系统。优选实施方式特别适合在大型临床实验室中应用，进行自动化PRA分析。所提供的方法具有增强的灵敏度，并在较短的时间内完成，以及具有比在其它PRA分析中所需较少的样本制备。
[0061]适当的检测样本包括可包含目标分析物的任何检测样本。在一些优选实施方式中，样本是生物样本；即，得自任何生物来源的样本，如动物、细胞培养物、器官培养物等。在某些优选实施方式中，样本得自哺乳动物，如狗、猫、马等。特别优选的哺乳动物是灵长类，最优选男性或女性人类。特别优选的样本包括血液、血浆、血清、唾液、脑脊髓液或其它组织样本。例如，这种样本可得自患者；即，活人一男性或女性，其本人为了疾病或病症的诊断、预后或治疗出现在临床环境中。检测样本优选得自患者，例如，血清或血浆。为了避免血浆肾素原的不可逆冷激活，应当将样本在室温下立即加工，或完全冷冻储存并在使用前立即解冻。
[0062]可应用多种温育条件以促进在色谱和或MS样本分析前由肾素制备和生成血管紧张素1，以使分析可自动化。本发明合并了适于进行血管紧张素I生成的试剂合剂(reagentcocktail)的单次添加。反应物合剂由在一个简单步骤中预混合全部试剂而制备。通过用水稳定性酶抑制剂例如氨乙基苄基磺酰氟(AEBSF)替代一般应用的水敏性酶抑制剂例如苯甲基磺酰氟(PMSF)，实现试剂合剂的这一单一生成。这尤其可用于大样本量的自动化，因为劳动密集型分析设备(labor intensive assay setup)需要水基试剂和水敏性酶抑制剂例如PMSF的混合。这种连续的添加需要各步骤之间剧烈的搅拌，从而保证温育前试剂溶液的同质性。此外，应当新制备PMSF，因为PMSF在水介质中不稳定。AEBSF具有比PMSF毒性少得多的附加益处。根据本发明，包含水稳定性AEBSF的试剂合剂与PMSF储备液相比具有意料之外的长稳定性特征。可将含AEBSF的试剂合剂在_20°C储存直至约6个月、或在室温下储存约一个星期。
[0063]本发明考虑用于血管紧张素I定量分析的试剂盒。本发明所述的用于血管紧张素I定量分析的试剂盒可包括这样的试剂盒:其包含对至少一次分析足够量的磷酸缓冲盐水溶液中的AEBSF。本发明所考虑的试剂盒也可包含同位素标记的内标和马来酸。如果试剂盒中需要包含降解标准品，可包含生成缓冲液(产生缓冲液，generation buffer),该缓冲液含有马来酸、AEBSF和降解标准品。一般地，试剂盒也会包含以有形形式(例如，包含在纸张或电子媒介上)记录的、使用该包装溶液用于测量分析来确定血管紧张素I含量的说明书。
[0064]利用模拟血清制备标准品和QC组,该模拟血清由用45mg/mL的牛血清白蛋白补充的磷酸盐缓冲液组成。没有人或非人血衆或处理血清(stripped serum)来源被识别为不包含可测量量的血管紧张素I。
[0065]一般地，迅速解冻冷冻的血浆样本和对照，从而防止在温育前肾素原至肾素的冷激活。将样本在37°C温育直至约3h。如果产生的样本没有生成令人满意的PRA测量，则可将温育时间延迟至达约18h。然后将样本冷冻(例如，送入约-20°C的温度)，从而使温育停止，并在该状态下储存直至分析。根据本发明，可在转换酶、降解标准品(缬氨酸和异亮氨酸同位素标记的血管紧张素I)和血管紧张素酶抑制剂(EDTA和AEBSF)的存在下，在37 0C ±1°下用内源性肾素底物(血管紧张素原)于PH5.7温育血浆肾素约I至2小时。
[0066]温育结束后，在LC纯化前将样本经过液-液萃取或固相萃取。在本发明中，利用与HPLC连接(联机或脱机)的适当固相萃取柱改变血管紧张素I的萃取。根据优选实施方式，该方法包括温育后向各样本添加蚁酸和将样本直接加样至与HPLC-质谱仪连接的固相萃取柱上。
[0067]包括高效液相色谱(HPLC)的液相色谱(LC)依赖于相对慢的层流技术。传统的HPLC分析依赖于柱填充，其中样本经柱的层流是来自样本的目标分析物分离的基础。技术人员会理解，在这样的柱中的分离是扩散过程，并且可选择HPLC设备和适用于血管紧张素I的柱。色谱柱一般包含基质(即，填料物质)从而促进化学部分的分离(即，分级)。介质可包括微粒。该颗粒包含与各种化学部分相互作用从而促进化学部分分离的连接表面。一种适当的连接表面是疏水连接表面，如烷基连接表面。烷基连接表面可包含C-4、C-8、C-12或C-18连接烷基，优选C-8或C-18连接基团。色谱柱包含从相连的SPE柱直接或间接接收样本的进口和排出流出物的出口，该流出物包括经分级的样本。在一个实施方式中，可在入口将样本(或预纯化的样本)施用于柱，用溶剂或溶剂混合物洗脱，并在出口排出。可为洗脱目标分析物(一种或更多种)选择不同的溶剂模式。例如，可应用梯度模式、等度模式或多型(即，混合)模式进行液相色谱法。色谱法期间，物质的分离通过变量实现，该变量如洗脱剂(也被称为“流动相”)的选择、洗脱模式、梯度条件、温度等。
[0068]在某些实施方式中，可通过在目标分析物被柱填料物质可逆保留、而一种或更多种其它物质未被保留的条件下将样本应用到柱，而纯化分析物。在这些实施方式中，可应用目标分析物被柱保留的第一流动相条件，并且一旦未被保留的物质被洗涤干净，可随后应用第二流动相条件，从柱去除被保留的物质。可选地，可通过在这样的流动相条件下将样本应用到柱而纯化分析物:目标分析物以与一种或更多种其它物质相比有差异的速率洗脱。这样的程序可富集一种或更多种目标分析物相对于一种或更多种其它样本组分的含量。
[0069]在另一个实施方式中，可在HPLC前将固相萃取(SPE)柱应用到疏水柱色谱系统上。在某些优选实施方式中，可将包含聚合物吸附剂的柱与HPLC系统联机连接。在某些优选实施方式中，将水中的HPLC级超纯0.1%蚁酸和乙腈中的0.1%蚁酸用作流动相，进行SPE柱和HPLC的样本纯化。优选地，这些实施方式所用的SPE柱能从血浆回收80%以上的血管紧张素。
[0070]通过阀门和连接器管道的仔细选择，可按需将一个或更多个固相萃取柱和色谱柱连接，以使物质从一个柱通过到达下一个柱，而不需要任何手动步骤。在优选实施方式中，通过预设程序的计算机控制阀门和管道的选择，以便进行必要步骤。最优选地，将色谱系统也以这种联机方式连接于检测系统，例如，MS系统。因此，操作员可在自动取样器中放置样本盘，并且在计算机的控制下进行剩余的操作，导致全部所选样本的纯化和分析。
[0071]利用质谱仪进行质谱分析，该质谱仪包含电离已分级样本和产生带电分子以用于进一步分析的离子源。在多个实施方式中，可通过任何技术人员已知的方法电离检测样本中存在的血管紧张素I。例如，可通过下列进行样本的电离:电子电离、化学电离、电子电离、化学电离、电喷雾离子化(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光致电离(APPI)、快原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸离子化(MALDI)、场电离、场解吸、热喷射/等离子体喷射电离、表面增强激光解吸离子化(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离。技术人员会理解，可基于要测量的分析物、样本类型、检测器类型、正模式对负模式的选择等来确定电离方法的选择。
[0072]在优选实施方式中，可通过电喷雾离子化(ESI)或基质辅助激光解吸离子化(MALDI)电离血管紧张素I。在进一步的优选实施方式中，通过正模式的加热电喷雾离子化(HESI)电离血管紧张素I。
[0073]电离样本后，可分析由此产生的带正电或带负电的离子，从而确定质荷比。确定质荷比的适当的分析器包括三重四极杆分析器(triple quadrupole analyzers)、四极杆分析器(quadrupole analyzers)、离子讲分析器、傅里叶变换分析器、orbitrap分析器和飞行时间分析器。可应用几种检测模式检测离子。例如，可应用扫描模式——例如，高选择性反应监测(H-SRM)、多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)—一检测所选离子，或者可选地，可应用选择性离子监测模式(SIM)检测离子。优选地，利用三重四极杆分析器确定质荷t匕。例如，在“四极杆”或“四极杆离子阱”装置中，振荡无线电频率场中的离子受到与电极间所用的DC电压、RF信号的振幅以及质/荷比成比例的力。可选择电压和振幅，从而仅具有特定质/荷比的离子穿过四极杆全长，而所有其它离子偏离。因此，四极杆装置可对注入该装置的离子既充当“质量过滤器”又充当“质量检测器”。一连串线性的三个四极杆被称为三重四极杆质谱仪。第一(Ql)和第三(Q3)四极杆充当质量过滤器，且中间的(Q2)四极杆用作碰撞单元。该碰撞单元是仅RF四极杆(非质量过滤)，其利用He、Ar或N气(?KT3Torr，?30eV)，引起来自Ql的所选母离子(一种或更多种)的碰撞解离。产生的碎片被送至Q3，在Q3处其可被完全过滤或扫描。
[0074]可通过应用“串联质谱法”或“MS/MS”提高MS技术的选择性。在该技术中，可在MS装置中过滤从目标分子生成的前体离子(也被称为母离子)，随后将前体离子碎片化，生成一种或更多种碎片离子(也被称为子离子或产物离子)，碎片离子随后在第二 MS程序中分析。通过前体离子的仔细选择，仅由某些分析物生成的离子被送至碎裂室，在碎裂室与惰性气体原子的碰撞生成碎片离子。由于前体离子和碎片离子均于给定电离/碎裂条件组下以可重现方式生成，MS/MS技术可提供极有力的分析工具。例如，可应用过滤/碎裂的结合去除干扰物质，并且过滤/碎裂的结合在复杂样本如生物样本中尤其有用。
[0075]质谱仪一般为使用者提供离子扫描；即，在给定范围内(例如，100至IOOOamu)具有具体质/荷的各离子的相对丰度。可通过多种本领域已知的方法将分析物分析——即质谱——的结果关联于原样本中分析物的量。例如，假定取样和分析参数被小心控制，可将给定离子的相对丰度与将该相对丰度转换为原分子的绝对量的表比较。可选地，分子标准品可随样本一起运行，并基于由该标准品生成的离子建立标准曲线。利用这样的标准曲线，可将给定离子的相对丰度转换为原分子的绝对量。在某些优选实施方式中，利用内标生成标准曲线，以用于计算血管紧张素I的量。生成和利用这种标准曲线的方法在本领域是公知的，并且普通技术人员能选择适当的内标。例如，同位素标记的血管紧张素I可用作内标；在某些优选实施方式中，标准品是同位素标记的血管紧张素1，其中缬氨酸亚基已完全被缬氨酸取代，其中碳原子已被13C同位素取代且氮原子已被15N同位素取代。将离子量关联于原分子量的众多其它方法会被本领域普通技术人员熟知。
[0076]在某些实施方式中，如MS/MS——这里前体离子被分离以用于进一步碎裂，通常利用碰撞活化解离来生成碎片离子，以用于进一步检测。在CAD中，前体离子通过与惰性气体的碰撞得到能量，且随后通过被称为“单分子分解”的过程碎裂。前体离子中必须聚集足够的能量，以使离子中某些键可由于增加的振动能而断裂。
[0077]在特别优选的实施方式中，如下利用MS/MS定量血管紧张素I。将样本经过液相色谱，优选固相萃取柱然后HPLC，来自色谱柱的液体溶剂流进入MS/MS分析器的加热雾化器接口(interface)，且在接口的加热管道中将溶剂/分析物混合物转化为蒸气。通过接口的电晕放电针使包含在雾化溶剂中的分析物(例如，血管紧张素I)电离，该电晕放电针向雾化溶剂/分析物混合物应用高电压。离子——例如，前体离子——经过装置口并进入第一四极杆。四极杆I和3(Q1和Q3)是质量过滤器，使离子(即，“前体”离子和“碎片”离子)基于其质荷比(m/z)得到选择。四极杆(Q2)是碰撞单元，在那离子被碎裂。质谱仪的第一四极杆(Ql)选择具有血管紧张素I质荷比的分子。具有正确的血管紧张素I质/荷比的前体离子被允许送入碰撞室(Q2)，而具有任何其它质/荷比的不需要的离子与四极杆的侧部碰撞且被去除。进入Q2的前体离子与中性碰撞气体分子一例如氩气分子一碰撞并碎裂。该过程被称为碰撞活化解离(CAD)。生成的碎片离子被送入四极杆3 (Q3)，在那里血管紧张素I的碎片离子被选择而其它离子被去除。
[0078]该方法可包括以正离子或负离子模式中进行的MS/MS。利用本领域公知的标准方法，普通技术人员能识别血管紧张素I的特定前体离子的一种或更多种碎片离子，该碎片离子可用于在四极杆3 (Q3)中选择。 [0079]随着离子与检测器碰撞，其产生电子脉冲，该电子脉冲被转换为数字信号。得到的数据被传递至计算机，其将所收集的离子数对时间作图。生成的质量色谱图与传统HPLC方法中生成的色谱图相似。测量相应于具体离子的峰下面积或该峰的振幅，并且将面积或振幅关联于目标分析物(血管紧张素I)的量。在某些实施方式中，测量碎片离子(一种或更多种)和/或前体离子的曲线下面积或峰的振幅，从而确定血管紧张素I的量。如上所
述，可利用校准标准曲线，基于分子内标--如同位素标记的血管紧张素I——的一种或
更多种离子的峰，将给定离子的相对丰度转化为原分析物——例如，血管紧张素I——的绝对量。
[0080]这些数据可被传递至计算机，其生成离子数对时间的作图。确定峰下面积，并通过将标准浓度对Angl/内标的峰面积比作图而建立校准曲线。利用校准曲线，确定样本中血管紧张素I和所选内标的量。可由这些确定量计算在给定时间内血管紧张素I形成的速率，SP，在样本温育期间形成的血管紧张素I的量。该速率表示样本中的肾素活性。
[0081]可手动或在计算机软件的协助下进行缩减(reduce)数据的基本过程。在根据下列计算确定最终PRA值中，血浆的稀释和生成时间被考虑:
[0082]
【权利要求】
1.测量样本中血管紧张素I的量的方法，所述方法包括: (a)电离来自所述样本的血管紧张素1，产生一种或更多种可由质谱检测的离子； (b)通过质谱检测所述血管紧张素离子(一种或更多种)的量，所述离子选自具有质/荷比 433.0±0.5,619.4±0.5,647.4±0.5 和 1297±0.5 的离子；以及 (c)利用所检测的离子(一种或更多种)的量来测量所述样本中血管紧张素I的量。
2.权利要求1所述的方法，其中所述方法具有小于或等于0.1ng/mL的定量极限。
3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过高效液相色谱(HPLC)从所述样本纯化血管紧张素I。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括用固相萃取柱从所述样本纯化血管紧张素I。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中通过与内标的比较，将所述血管紧张素I离子的量关联于检测样本中血管紧张素I的存在或量。
6.测量样本中血管紧张素I的量的方法，所述方法包括: (a)在适于所述样本中的肾素生成血管紧张素I的条件下，温育与水稳定性蛋白酶抑制剂预混合的所述样本，所述水稳定性蛋白酶抑制剂对肾素无效； (b)通过液相色谱纯化所述样本中的血管紧张素I; (C)电离来自所述样本的所述纯化的血管紧张素I，产生一种或更多种可由质谱检测的离子； (d)通过质谱检测所述血管紧张素I离子(一种或更多种)的量；以及 (e)利用所检测的离子(一种或更多种)的量来测量所述样本中血管紧张素I的量。
7.权利要求6所述的方法，其中所述方法具有小于或等于0.1ng/mL的定量极限。
8.权利要求6-7中任一项所述的方法，其中所述血管紧张素I离子包括选自具有质/荷比433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5和1297 + 0.5的尚子的一种或更多种尚子。
9.权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述电离包括生成具有质/荷比433.0±0.5的前体离子、和生成选自具有质/荷比619.4±0.5和647.4±0.5的离子的一种或更多种碎片离子。
10.权利要求6-9中任一项所述的方法，其中通过与内标的比较，将所述血管紧张素I离子的量关联于检测样本中血管紧张素I的存在或量。
【文档编号】G01N30/88GK103743848SQ201310436176
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2009年8月7日 优先权日:2008年8月8日
【发明者】C·E·拜尔斯特姆, R·E·瑞茨, N·J·克拉克 申请人:奎斯特诊断投资公司