特异于人类膜结合型IgE的CEMX上的新颖抗原决定部位的抗体及其用于治疗IgE介导的疾 ...的制作方法
【专利说明】特异于人类膜结合型丨gE的CEMX上的新颖抗原决定部位的 抗体及其用于治疗IgE介导的疾病的用途
[0001] 相关申请案交互参照
[0002] 本专利申请案根据35U. S. C. § 119 (e)主张于2013年3月13日提交的第 61/779, 271号美国临时专利申请的优先权，其内容在此被全部纳入作为引用。
【背景技术】
[0003] 免疫球蛋白E(IgE)在调节第一型过敏反应中扮演着非常重要的角色，其会引起 过敏疾病，包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮肤炎、花生过敏、乳胶过敏等。过敏反应 是免疫系统对环境无害的物质，例如尘螨、树和草花粉、某些食物及药物、以及蜜蜂和火蚁 叮咬的反应。在这样的反应中，过敏原与嗜碱性球及肥大细胞表面的IgE结合，会造成IgE 的交联以及下方受体IgE. Fc的聚集，又称第一型IgE. Fc受体或Fc e RI。该受体聚集随后 激活讯息传递路径，并造成颗粒细胞的胞吐作用和药理介质，例如组织胺、白三烯、类胰蛋 白酶、细胞激素和趋化激素的释放。从肥大细胞和嗜碱性球释放出的介质引起过敏的各种 病理表现。
[0004] 可与血液和组织间液中游离的IgE以及B细胞上的mlgE结合，但不会与结合在嗜 碱性球及肥大细胞上Fc e RI受器的IgE结合的抗IgE抗体，例如奥马佐单抗（Omalizumab) 及TNX-901，已被发展于治疗IgE介导的过敏性疾病中。这些抗体以高亲和力结合于IgE上 位于Fc的CH3结构域，其与Fc e RI之结合位置重迭。因此，这些抗体的预期治疗效果是基 于抗体结合于游离的IgE以及B淋巴球及记忆B细胞上的mlgE，此导致在血液和组织间液 中整体游离的IgE浓度降低。
[0005] 在临床发展上，奥马佐单抗（商品名为Xolair)额外表现出多种可降低第一型过 敏的药理作用。抗IgE抗体与游离IgE的结合进一步防止IgE结合于嗜碱性球与肥大细胞 上的Fc e RI。由于未被IgE占用的Fc e RI是不稳定的且随后会被细胞内化并降解，因此， 因与抗IgE抗体结合而造成的游离IgE的消耗也会逐渐调降嗜碱性球与肥大细胞上Fc e RI 的表现量。对于抗体治疗的其它效果的证据已被发现，包括细胞激素活性的中和作用、总体 炎症活性的衰减、并可能藉由IgE-抗IgE免疫复合物的累积而清除过敏原。
[0006] C e mX是位于人类膜结合型e链（m e )上CH4结构域与C端膜镶嵌片段间的52 个氨基酸片段。据显示，在大多数人类受试者的研究中，不含CemX的me (meS)占极小的 比例，而含有C e mX的m e (m e L)链是显著表现的。分泌出的游离IgE的e链以及mlgE 的m e S与m e L的mRNAs皆来自于e RNA转录体的选择性剪接。在整个蛋白质及DNA数据 库中，C e mX的氨基酸与核苷酸序列是独特的。因此，C e mX提供一个独特的抗原位点，供标 定mlgE和表现mlgE的B细胞。
[0007] 已开发出结合于CemX(亦被理解为Ml'区域，或Ml'胜肽）的抗IgE抗 体，CemX存在于人类mlgE上供标定表现mlgE的B淋巴球。参见如〇16116七31.，工 Immunol.，184:1748-1756, 2010 ;美国专利第8, 071，097号；以及世界专利第 W02010/097012 号。
[0008] 在C e mX结构域中鉴定出新的抗原决定部位，以及发展结合于该抗原决定部位的 新型治疗用抗体是很有意义的。
【发明内容】
[0009] 本揭露是基于非连续的线性抗原基序（motif) AAGGSVPHPRCHCGAGRA (SEQ ID NO: 1)的惊人发现，其横跨IgE之C e mX结构域中的29-46号氨基酸残基，亦基于发展出至 少一种单株抗体，其能够结合于该基序，并能有效地在表现出膜结合型IgE之B细胞中，诱 导抗体依赖型细胞毒性（ADCC)和细胞凋亡。这新发现的抗原基序与抗体接合的可行性是 无法预测的，此乃因为这18个氨基酸长的片段与CemX(即，RADWPGPP，SEQ ID N0:7)的 C_末端片段上的两个氨基酸残基重迭，已知，这会阻碍抗体的结合。
[0010] 因此，本揭露之一方面的特征为一种结合于AAGGSVPHPRCHCGAGRA (SEQ ID NO: 1)， 或其中的抗原决定部位，如SVPHPRCHCGAGRA(SEQ ID N0:4)的经分离抗IgE抗体。此抗IgE 抗体可以是全长抗体或者其抗原结合片段，其包括但不限定于Fab片段、F (ab'）2片段、或 单链Fv片段。本文所示的抗IgE抗体亦可以是人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、或单链抗 体。
[0011] 在某些具体实施例中，本文所述的抗IgE抗体包括重链变异区（VH)，其包含如SEQ 10勵：12所示的￥"互补性决定区域（〇?)1、如3￡0 10勵：13所述的￥"〇)1?2、以及如3￡0 ID N0:14所述的VH OTR3。另外或此外，该抗IgE抗体可包括轻链变异区（\)，其包含如SEQ 10勵:15所示的\001?1、如5￡〇10勵:16所示的\〇01?2、以及如5￡〇10勵:17所示的 VL CDR3〇
[0012] 在其他具体实施例中，该抗体包括与SEQ ID N0:8至少85 % (例如： 90% ,95% ,97% ,98%，or 99%)相同的VH。此外，该抗IgE抗体包括与SEQ ID N0:9至 少85% (例如：90% ,95% ,97% ,98%，or 99% )相同的\。该抗IgE抗体结合于与具 有如SEQ ID N0:8所示的VH以及如SEQ ID N0:9所示的^的抗IgE抗体相同的抗原决定 部位。在一实例中，该抗IgE抗体包括如SEQ ID N0:8所示的VH以及如SEQ ID N0:9所示 的VL。
[0013] 又一方面，本揭露提供一种经分离纯化的核酸，其包括编码包括如SEQ ID NO: 12 所示的VHS补性决定区域（CDR) 1、如SEQ ID NO: 13所示的V H CDR2、以及如SEQ ID NO: 14 所示的VH OTR3的抗体重链变异区（VH)的核苷酸序列，及/或编码包括如SEQ ID NO: 15所 示的\互补性决定区域（CDR1)、如SEQ ID NO: 16所示的CDR2、以及如SEQ ID NO: 17所 示的\ CDR3的抗体轻链变异区（\)的核苷酸序列。此处也提供一种载体（例如：基因表 现载体），其包括本文所述之任何核酸，以及包含这些载体的宿主细胞。在某些实例中，本文 所述之载体（例如：表现载体）包括本文所述的任何抗IgE抗体上之重链和轻链两者的编 码核苷酸序列。在其他实例中，编码重链和轻链的核苷酸序列是位于不同的载体上。
[0014] 另一方面，本揭露提供一种制备任何本文所述抗IgE抗体的方法，该方法包括培 养含有编码该抗体的重链和轻链的表现载体的宿主细胞，以及收集经培养的细胞供所产生 的抗体的纯化。此一方法可进一步包括从经培养的细胞中或培养基中分离出抗体。
[0015] 再者，本揭露提供一种组合物（例如：医药组合物），其包含任何本文所述的抗IgE 抗体或任何本文所述的核酸或载体，以及一种载体，例如药理上可接受的载体。
[0016] 此外，本揭露提供一种免疫组合物，其包括胜肽和佐剂，其中该胜肽包括氨基 酸序列AAGGSVPHPRCHCGAGRA(SEQ ID NO: 1)，或任何其中的免疫性抗原决定部位，例如： SVPHPRCHCGAGRA(SEQ ID N0:4)。在某些实例中，该胜肽是共辄于载体上。此种免疫组合物 可用于引发针对该胜肽的专一性免疫反应。
[0017] 又一方面，本揭露的特征是一种治疗患者的IgE介导的疾病的方法，该方法包括 给予所需患者施用有效剂量的：（i)任何本文所述的组合物，其包括任何该抗IgE抗体或编 码该抗体的核酸，或（ii)任何本文所述的免疫组合物，其包括AAGGSVPHPRCHCGAGRA(SEQ ID N0:1)的胜肽，或任何其免疫抗原决定部位，例如：SVPHPRCHCGAGRA(SEQ ID N0:4)〇
[0018] IgE介导的疾病实例包括但不限定于，冷诱发荨麻疹（cold-induced urticaria)、 慢性荨麻疼（chronic urticaria)、胆喊能性荨麻疼（cholinergic urticaria)、慢性鼻 窦炎（chronic rhinosinusitis)、全身性肥大细胞增多症（systemic mastocytosis)、 皮肤肥大细胞增多症（cutaneous mastocytosis)、过敏性支气管肺曲菌症（allergic bronchopulmonary aspergillosis)、复发型特发性血管性水肿（recurrent idiopathic angioedema)、间质性膀胱炎（interstitial cystitis)、嗜酸性球相关性胃肠障碍（an eosinophil-associated gastrointestinal disorder)、过敏性哮喘（allergic asthma)、 过敏性鼻炎（allergic rhinitis)或异位性皮肤炎（atopic dermatitis)。在一些实例中， IgE介导的疾病是过敏性哮喘、过敏性鼻炎或异位性皮肤炎。
[0019] 需要本文所述治疗的患者可为患有或疑似患有IgE介导病症的患者（例如，人类 患者）。
[0020] 亦在本发明范畴中的是用于治疗如上述所列IgE介导的疾病的医药组合物或免 疫组合物。该医药组合物包括任何抗IgE抗体或编码该抗体的核酸以及药理上可接受的载 体。该免疫组合物包括至少一 AAGGSVPHPRCHCGAGRA(SEQ ID N0:1)胜肽，或任何其中的免 疫抗原决定部位，例如：SVPHPRCHCGAGRA(SEQ ID N0:4)，以及视情况而选择的佐剂。再者， 本发明包括此医药或免疫组合物在制造用于治疗IgE介导的疾病的药物的用途。
[0021] 本发明的一个或多个具体实施例的细节是于下面的说明中阐述。其它本发明的特 征或优点将由以下附图和几个详细描述的具体实施例，亦可从所附的权利要求中，得到更 佳理解。
【附图说明】
[0022] 首先说明图例。
[0023] 图1显示单株抗体mAb 23B1与各种由C e mX衍生的胜肽间的结合活性。A :C e mX 结构域的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)，以及横跨CemX结构域的其他合成胜肽序列（顶部到 底部分别为 SEQ ID NOs: 1 及 3-6)。B :图谱表示 mAb 23B11、mAb26H2、mAb h26All 及 mAb a20与各种合成CemX胜肽片段的反应性，其是由酵素连结免疫吸附法（ELISA)所测定。
[0024] 图2为表示mAb 23B11对于表现mlgE. ?(\的Ramos品系的结合亲和力图谱（线 条轮廓）。mAb 23B11对于表现mlgE. Fcs的细胞的结合如背景图所示（阴影曲线图）。将 1^111〇8细胞在冰上与10、5、2.5、1.25及0.625 1^/1111之滅&23811或滅&26112(做为控制 组）培养20分钟，接着以FITC标示的专一性兔F(ab'） 2抗鼠IgG进行染色。
[0025] 图3为显示表现mlgE的Ramos细胞暴露于mAb 23B11的细胞凋亡速率图。使用 Mab 7C3抗体，其为migis-a (IgA膜镶嵌a链的C端膜镶嵌胜肽在细胞外侧的片段）的专 一抗体，作为同型（isotype)mAb控制组，而mAb 26H2则做为阳性控制组。由三次独立试验 的结果，以三重复之平均值土标准偏差呈现。
[0026] 图 4 显示小鼠 mAb 23B11VH结构域（SEQ ID N0:8)和 结构域（SEQ ID N0:9)的 氨基酸序列，分别与小鼠重链亚群1(HV1) (SEQ ID N0:10)和轻链k亚群13(KV2) (SEQ ID N0:11)的一致性序列比较。每个链中的三个CDR以底线标示。VH CDR1:SEQ ID N0:12;Vh CDR2:SEQ ID N0:13;以及VH CDR3:SEQ ID N0:14;\ CDR1:SEQ ID N0:15;\ CDR2:SEQ ID N0:16 ;VL CDR3:SEQ ID N0:17。
【具体实施方式】
[0027] 本揭露报导非可预期性的鉴定出存在于B细胞上的膜结合型IgE的C e mX结构域 (SEQ ID N0:2)中的抗原片段 AAGGSVPHPRCHCGAGRA(SEQ ID N0:1)。单株抗体 23Bll(mAb 23B11)，其可与位于此片段上的抗原决定部位结合，进而有效诱发表现膜结合型IgE的B细 胞进行凋亡和ADCC。其他习知技艺中的单株抗体（例如：mAb a20、mAb 4B12、mAb 26H2、 滅匕47財、滅6 746与滅6 26411)并不会与此抗原片段结合。参见美国专利第8,460,664 及 8, 071，097 号。
[0028] 因此，本揭露提供可与AAGGSVPHPRCHCGAGRA(SEQ ID N0:1)或其中的抗原决定 部位（例如：SEQ ID N0:4)结合的经分离抗体、编码该抗体重链及轻链的核酸、包含任何 该抗IgE抗体或编码该抗体的核酸的医药组合物、生产该抗体的方法以及使用任何该抗 体或编码的核酸于治疗IgE介导的疾病的方法。亦在揭露明范围内的是包含该抗原胜肽 AAGGSVPHPRCHCGAGRA(SEQ ID N0:1)或其中的抗原决定部位的免疫组合物，以及其用于处 理任何本文所述抗IgE抗体的用途。
[0029] 通用技术
[0030] 除非另有说明，本发明的实践将采用分子生物学（包括重组技术）、微生物学、 细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这是在本领域的技术范围内。这些技术在以 下文献中充分解释，例如，举例而言：Molecular Cloning:A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989)Cold Spring Harbor Press ；01igonucleotide Synthesis(M. J. Gait, ed. , 1984) ；Methods in Molecular Biology, Humana Press ；Cell Biology:A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed. , 1998)Academic Press ；Animal Cell Culture(R. I. Freshney,ed.,1987) ；Introduction to Cell and Tissue Culture(J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. ,1993-8)J. Wiley and Sons ；Methods in Enzymology(Academic Press, Inc. ) ；Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos,eds. , 1987) ；Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel, et al.,eds. , 1987) ；PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al. , eds. , 1994) ；Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan et al. , eds. ,1991) ；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)； Immunobiology(C. A. Janeway and P.Travers, 1997) ；Antibodies (P.Finch, 1997)； Antibodies:a practical approach(D. Catty. , ed. , IRL Press, 1988-1989)； Monoclonal antibodies:a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds. , Oxford University Press, 2000)