三螺旋蛋白的纯化的制作方法

三螺旋蛋白的纯化的制作方法
【专利说明】三螺旋蛋白的纯化
[0001] 其他申请的交叉参考
[0002] 本文所引用的所有公开案、专利、专利申请和其他参考均以全文引用的方式并入， 如同表明每个个别公开案、专利、专利申请或其他参考具体且单独地以引用的方式并入一 般。
[0003]本申请要求 2013 年 3 月 21 日申请、标题为"Purificationoftriplehelical proteins"的澳大利亚专利申请号2013900990的优先权。此申请的全部内容以引用的方式 并入本文。
[0004] 序列表
[0005] 本申请与电子形式的序列表一起提交。序列表的全部内容以引用的方式并入本 文。
[0006] 公开领域
[0007] 本发明涉及一种用于纯化从细菌、酵母或植物宿主细胞重组产生的三螺旋或胶原 蛋白状蛋白质的方法。
[0008] 背景
[0009] 胶原蛋白是动物的细胞外基质中的主要结构蛋白，且定义为需要（Gly-Xaa_Yaa)n 重复序列的特征性三螺旋结构。在Xaa和Yaa位置中发现的氨基酸常为脯氨酸，其中Yaa位 置中的Pro经翻译后修饰为羟脯氨酸（Hyp)，所述羟脯氨酸提升三螺旋稳定性。在人类中， 存在至少28种胶原蛋白类型的家族，各自具有类型特异性生物学功能和结构功能。三螺旋 基序也存在于其他蛋白质中，诸如巨噬细胞清道夫受体、胶原凝集素和Clq。
[0010] 最丰富的胶原蛋白为间质、原纤维形成胶原蛋白，尤其是I型胶原蛋白。这些胶原 蛋白经由形成通过特异性交联稳定的纤维束网状物来在动物中形成主要组织结构，以使组 织具有稳定性和强度。与'大'原纤维形成胶原蛋白（I型、II型和III型）相反，'小'胶 原蛋白分布一般较不广泛，且通常发现于其中小胶原蛋白可为重要和关键成分的特定组织 位置中；例如肥大软骨中的X型胶原蛋白或基底膜中的IV型胶原蛋白。
[0011] 已显不|父原蛋白在各种临床应用中的多种医学广品中安全且有效（Ramshaw等 人，JMaterialsScience，MaterialsinScience, (2009)，20(1)第 3-8 页）。对医学应用 而言，胶原蛋白一般以两种明显相异的形式使用。在一种形式中，在化学稳定化之后使用完 整组织，诸如在主动脉瓣膜替换中使用戊二醛固定的猪心瓣膜。另一种形式为经由制备经 纯化的可溶性胶原蛋白（诸如适用于伤口涂剂的无水稳定化薄片或挤压纤维、用于半月板 修复的粘附屏障或装置），所述可溶性胶原蛋白复原为各种产品且加工得到产品的所需形 状或形式。必要时，胶原蛋白装置可通过化学固定（例如戊二醛）或通过物理方法（例如 干热交联）而稳定化。经纯化的可溶性胶原蛋白也广泛用作用于软组织加强以及还用于治 疗尿失禁的胶原蛋白浆。复原产品的特征在于较高生物化学纯度，所述较高生物化学纯度 与组织中的生物学功能中至关重要的低免疫原性、受控转换（常经较短时间段）、受控孔隙 度和细胞-基质相互作用的滞留相关。
[0012] 为纯化来自动物胶原组织的胶原蛋白，典型方法包括经由使用酶消化步骤以移除 交联区而保留三螺旋完整，来使组织初始消化和溶解。溶解的胶原蛋白可随后经纯化以移 除潜在免疫原性污染物。例如，US6548077描述来自组织的胶原蛋白的制备，其涉及使胶原 蛋白与第一蛋白水解酶接触，接着与还原剂和第二蛋白水解酶接触。
[0013]Addad等人（Mar.Drugs(2011)，9 (6)，967-983)描述使用组织提取物的酸性胃蛋 白酶溶解作用来纯化来自水母的胶原蛋白。然而，为获得稳定和适用的最终产物，需要交联 步骤。用酸且具体地用乙酸处理导致组织膨胀，并且在胃蛋白酶消化之后得到可溶性胶原 蛋白。所得可溶性胶原蛋白产物将是可能需要复原为不溶形式以用于许多医学应用的弱的 非纤维材料。
[0014] 已公开的替代性方法包括将富含胶原蛋白的天然动物组织研磨成极精细粒子，所 述粒子可在加工成适用的医学材料之前或之后经洗涤为无杂质。
[0015] 大部分商业量的胶原蛋白来源于动物（诸如牛来源），但担心可具有可传染的疾 病，尤其牛海绵状脑病（'疯牛病'），已在产生重组形式的胶原蛋白上花费研究努力。此外， 来源于动物的胶原蛋白受到限制，因为所提取的胶原蛋白无法经设计和修饰以增强或改变 特定生物学特性。胶原蛋白在沉积于细胞外基质中之前和之后经受大量翻译后修饰。具体 地，原纤胶原蛋白在细胞外空间中经受持续分子寿命的分子内和分子间交联。因此，存在于 胶原蛋白中的交联量除了其他以外还受到收集胶原蛋白的组织的寿命和生理学影响。这些 差异影响来自组织的胶原蛋白的可提取性和这些胶原蛋白的生物物理学特征。因此，从组 织分离的胶原蛋白表现出显著批次间变化，且作为块状材料在分析上常常难以处理。
[0016] 因此，关注已从动物胶原蛋白的分离转移至重组胶原蛋白的产生。
[0017] 此外，需要使用重组DNA技术，因为所述技术可能允许产生合成胶原蛋白和胶原 蛋白片段，所述胶原蛋白和胶原蛋白片段可包括例如外源性生物活性结构域（即提供额外 蛋白质功能）和其他适用的特征（例如改善的生物相容性和稳定性）。
[0018] 已探索诸如酵母的宿主系统来重组产生人类编码的胶原蛋白。然而，酵母系统是 复杂的，因其需要引入脯氨酸-4羟化酶的基因来形成哺乳动物胶原蛋白的稳定性所需要 的Hyp残基。通常，重组哺乳动物编码的胶原蛋白表达在毕赤酵母（Pichia)中，需要添加 氧气来得到最大羟基化，以及添加甲醇用于诱导，这产生对增强的潜在防火工程的需要。
[0019] 已寻找到不需要翻译后修饰的其他胶原蛋白状物质来作为羟基化的人类胶原蛋 白的替代。最近，对细菌基因组的研究已表明，存在许多每三个残基含有一个Gly且脯氨 酸含量较高的假定的细菌蛋白，表明胶原蛋白状三螺旋结构可存在于某些来源于细菌的蛋 白质中（PengY等人（2010)Biomaterials31 (10): 2755-2761;YoshizumiA等人（2009) ProteinSci18:1241-1251)。此外，已显示若干这些蛋白质形成即使不存在Hyp也在约 37°C下稳定的三螺旋。已在多种情况下确认三螺旋组合物。实例包括某些细菌细胞上的细 胞表面蛋白和炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis)孢子上的长丝。已假定所述胶原蛋白 状构建体在存在于病原性大肠杆菌（Ecoli)菌株中的原噬菌体中的表达似乎为造成毒性 相关的基因经由感染传播的原因（BellaJ等人（2012) 7(6)PLoSle37872)。
[0020] 然而，使用重组技术仍具有其缺点和障碍。使用宿主细胞来产生外来蛋白增加挑 战，诸如移除存在于所需蛋白质的最终制剂中的污染性宿主细胞蛋白可导致有害毒性或免 疫反应。如果重组蛋白是在细胞内制得，那么纯化方法的第一步骤涉及裂解或破坏细胞，这 将细胞的内容物释放至匀浆物中且另外产生亚细胞片段。如果重组蛋白是从细胞分泌的， 那么细胞的自然死亡和将细胞内宿主细胞蛋白释放至上清液中也可产生毒性和免疫原性 污染。为移除这些污染物，通常需要许多不同的纯化步骤。通常采用亲和层析法来达到高 纯度水平。此后续加工一般是劳动和资源密集型的，且对大规模商业生产而言成本过高。
[0021] 重组胶原蛋白状蛋白质的大规模生产仍处于其发展初期。存在大规模生产必须处 理的某些挑战，包括工艺的可缩放性、生产成本、提取方法的复杂性、对GMP需求的顺应性、 对调控需求的顺应性、污染性宿主细胞蛋白的移除、纯化方法的复杂性、宿主细胞的适合 性。例如，人类细胞系仅促成中度产率，对有成本效益的更大规模的生产而言是不适合的。
[0022] 因此，需要用于纯化重组产生的胶原蛋白的方法，其中所述方法具有成本效益且 促成以高产率和用于各种应用的足够纯度来生产胶原蛋白。
[0023] 公开概述
[0024] 本发明人已开发出一种用于纯化由非动物宿主细胞（诸如细菌、酵母或植物细 胞）表达的重组三螺旋蛋白的方法。所述方法提供在整个纯化方法中保持可溶的可溶性三 螺旋蛋白的纯化。此外，所述方法不导致三螺旋蛋白的变性、降解或水解。
[0025] 本公开的方法提供重组三螺旋蛋白（来自任何来源）的纯化，所述纯化导致所产 生的溶解的三螺旋蛋白（例如胶原蛋白）是稳定且不含污染性蛋白（其可损害三螺旋蛋白 的稳定性）的，并且因工艺步骤最少化而可以高产率来进行生产。有利的是，所述方法提供 一种用于纯化三螺旋蛋白（例如胶原蛋白）的有成本效益的方法，所述三螺旋蛋白在酸性 条件下稳定且以用于多种不同应用的足够纯度来进行生产。
[0026] 本公开因此提供一种用于纯化在非哺乳动物宿主细胞培养提取物或均质物内含 有的重组表达三螺旋蛋白的方法，所述方法包括：
[0027] (i)在酸性条件下和在所述三螺旋蛋白保持热稳定的温度下从所述三螺旋蛋白质 沉淀宿主细胞物质；接着；
[0028] (ii)通过添加蛋白酶来消化存在于所述经沉淀的宿主细胞培养提取物或匀浆物 中的宿主细胞物质，其中所述三螺旋蛋白对所述蛋白酶具有抗性；以及
[0029] (iii)收集所述经纯化的三螺旋蛋白；并且
[0030] 任选地在所述沉淀步骤与所述消化步骤之间还包括额外分离步骤，所述分离步骤 以物理方式从不溶性宿主细胞物质分离所述三螺旋蛋白；并且
[0031] 其中所述三螺旋蛋白在至少步骤（i)和（ii)中均保持可溶。
[0032] 在一个实例中，所述三螺旋蛋白在步骤（i)至（iii)中均保持可溶。
[0033] 在一个实例中，宿主细胞物质的所述消化步骤使用酸性蛋白酶来进行。
[0034] 在一个实例中，所述方法还包括收集宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为细菌、酵 母或植物宿主细胞。用于培养本发明的宿主细胞的方法对本领域技术人员而言将为熟悉 的，且描述于本文中其他地方。
[0035] 在一个实例中，所述酸性条件是指培养提取物或匀浆物的pH值在小于7的pH值 下，优选地在小于约6的pH值下。
[0036] 根据本发明的方法，三螺旋蛋白有利地保持热稳定。本领域技术人员将了解可向 培养提取物或匀浆物中添加用于辅助维持三螺旋蛋白的热稳定性的某些试剂或添加剂。例 如，可添加抗冷冻剂（诸如NaCl)或提供稳定性的其他添加剂，诸如聚乙烯醇、聚氧化乙烯、 聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙二醇（PEG)或其衍生物、甲基纤维素、琼脂糖、糊精、羟 乙基淀粉、N-氧化三甲胺（TMAO)等。在一个实例中，如果在小于三螺旋蛋白的熔化温度的 温度下进行所述沉淀步骤，那么所述三螺旋蛋白的热稳定性得以维持。在另一个实例中，在 酸性沉淀条件下在比三螺旋蛋白的TJ氐至少10°C的温度下维持所述三螺旋蛋白质的热稳 定性。测定三螺旋蛋白的热稳定性的方法描述于例如US8, 280, 710中。
[0037] 本公开的方法包括任选的中间分离步骤，所述分离步骤用于从所沉淀的宿主细胞 物质诸如宿主细胞蛋白和/或宿主细胞DNA分离三螺旋蛋白。可在此任选的步骤中采用任 何分离工艺来移除这些物质中的一种或两种。所述工艺优选为粗分离或浓缩技术，诸如离 心、过滤、交叉流过滤或沉降。
[0038] 在另一个实施方案中，在根据本发明的方法的消化步骤之前或与其同时可必需另 一个pH值调节。根据用于消化步骤的蛋白酶，可能需要向上或向下调节pH值，其限制条件 为三螺旋蛋白保持在溶液中。例如，如果使用胃蛋白酶作为蛋白酶，则可能必需在添加胃蛋 白酶之前降低培养提取物或匀浆物的pH值。所述调节完全处于本领域技术人员的技能内。
[0039] 本领域技术人员应了解，将用包含编码三螺旋蛋白的序列的重组构建体转化或转 染的宿主细胞在适合于使得所述三螺旋蛋白表达的条件下培养。在一些实例中，将以细胞 内方式产生三螺旋蛋白，在此情况下，必需从细胞提取三螺旋蛋白。提取方法将需要使宿主 细胞破裂。提取可通过本领域技术人员已知的机械或化学（例如酶）手段来达到。机械 提取工艺的实例可包括以下中的一种或多种：声波处理、微流体化、在弗氏压碎器（French Press)或相似设备中裂解、渗透猝震、和通过与玻璃、陶瓷或钢珠一起剧烈搅拌/研磨来破 坏。作为替代方案，或与机械提取结合，也可采用酶提取。适合于酶提取的试剂的实例包括 溶菌酶、溶葡球菌酶、消解酶、纤维素、变溶菌素、聚糖酶、蛋白酶、甘露糖等。
[0040] 在一些实例中，三螺旋蛋白是从宿主细胞分泌的（即，如在一些酵母系统中的情 况下，以细胞外方式产生）。在那些情况下，不必需提取，然而，细胞培养提取物可经浓缩，由 此通过本领域中已知的方法产生匀浆物或滤液，以获得包含所回收的可溶性三螺旋蛋白的 溶液。在另一实例中，细胞培养基与三螺旋蛋白一起通过交叉流过滤来浓缩。
[0041] 相应地，本公开的方法可包括一种产生含有三螺旋蛋白的宿主细胞培养提取物或 匀浆物的额外步骤。
[0042] 根据本公开的方法，通过酸性沉淀步骤来从含有重组三螺旋蛋白的细胞培养提取 物或均质物中移除细胞污染物和碎片。本发明人已发现，通过在三螺旋蛋白保持热稳定的 温度下将溶液的pH值调节为酸性条件，在许多污染性（即不溶性）物质沉淀的同时，重组 三螺旋蛋白质不变性且保持在溶液中。因此，本发明具有在此第一纯化步骤中三螺旋蛋白 的pH值稳定性的优势。
[0043] 优选地，温度在整个方法中为恒定的。在一个实例中，温度维持在室温下（即在约 18°C与 24°C之间）。
[0044] 在一个实例中，在酸性沉淀步骤期间，温度比重组三螺旋蛋白的熔化温度（TJ低 至少10 °c或更多。
[0045] 含有重组三螺旋蛋白的溶液的酸化可通过任何适合的酸（包括强酸或弱酸）来达 到。可使用单一酸，或者可使用不同酸的组合。根据所述方法合适的酸的实例包括盐酸、硫 酸、乙酸、甲酸或乳酸，但本领域技术人员熟悉的其他酸也将是合适的。相应地，根据重组蛋 白在酸化溶液的pH值下的，酸化发生的温度可在4°C与30°C之间变化。
[0046] 在下表中提供各种细菌物种的三螺旋胶原蛋白状（CL)结构域的熔化温度的实 例。
[0047] 表1胶原蛋白状（CL)结构域的熔化温度
[0048] 物.翁 结构域Tm(中性卩曰值}Tm(酸性pH值） __V 产气荚膜梭菌(Clostridium CL 38.8 37.2 perfringens) Soi'ibacter usitatus CL 38.5 27.0 甲基杆菌（Methylobactcrium C,L 35.0 28.3 sp. ) 4-46
[0049] 沼泽红假单胞菌 CL 37>0 32,0 (Rhodopscudomonaspaluslris) 化脓性链球菌(Streptococcus C.L 35,9 25,7 pyogcncs)(Scl2) 化脓性链球菌(Scl2) CL-CL 36.5
[0050] 在酸性沉淀步骤期间，含有重组三螺旋蛋白的细胞培养提取物或匀浆物的经调节 的pH值将取决于宿主细胞和三螺旋蛋白序列。在一个实例中，包含三螺旋蛋白的细胞培养 提取物或匀浆物的pH值调节至小于7。在另一个实例中，对细菌宿主细胞，介于2与4之间 的pH值优选，而对酵母宿主细胞，介于4与6之间的pH值较佳。在对植物宿主细胞的另一 个实例中，介于2与4. 5之间的pH值优选。
[0051] 在某些实例中，对重组三螺旋蛋白的植物细胞表达而言，酸性沉淀步骤可在两种 不同的pH值下进行。例如，在提取物中最丰富的植物蛋白为核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶 (Rubisco)的情况下，其最优选在约4. 5的pH值下沉淀。然而，此pH值通常不足以移除所 有污染性植物蛋白，在此情况下，可必需接着进行pH值2. 5下的另一个沉淀。
[0052] 因此，酸性沉淀步骤可需要调节pH值以使存在于提取物中的连续污染性蛋白质 沉淀。优选地，所沉淀的蛋白质将根据上述方法在后续pH值调节之间移除。
[0053] 根据本公开的方法，在酸性沉淀步骤之后为消化步骤。本发明人已发现，消化步骤 移除在提取工艺（其中产生培养提取物或匀浆物）中生成的宿主细胞污染物或在沉淀步骤 回收三螺旋蛋白期间未移除的宿主细胞污染物。通常，消化步骤将导致移除易于酶消化的 污染性宿主细胞蛋白，例如膜蛋白。在另一个实例中，使用蛋白酶，优选酸性蛋白酶来进行 消化步骤。适用于根据本公开的方法的酸性蛋白酶的实例包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜 蛋白酶状酶（诸如菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶或奇异果蛋白酶）、或佐氏曲霉酸性蛋白酶。
[0054] 非酸性蛋白酶也可用于本发明的消化步骤，诸如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。根据 所采用的蛋白酶，可必需将pH值调节至酸性较弱条件（例如对诸如木瓜蛋白酶的蛋白酶）。 本领域技术人员将熟悉所述策略。
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