0055] 在一些实例中，蛋白酶消化可通过将培养提取物或匀浆物的pH值调节至中性pH 值来终止。
[0056] 应了解所述方法产生对蛋白水解稳定的三螺旋蛋白的纯化。三螺旋蛋白也可包括 对经选择以用于移除宿主蛋白的酶为蛋白水解稳定的额外非螺旋蛋白序列，和/或天然地 或通过设计以对所述酶为蛋白水解稳定的非三螺旋序列插入。因此，本公开的方法也具有 相比于对蛋白水解不稳定的蛋白质，选择性纯化对蛋白水解稳定的蛋白质的优势，且因此 选择性纯化三螺旋蛋白超过其他非三螺旋蛋白。
[0057] 蛋白酶将许多污染性蛋白质消化为因分子量比完整可溶性重组三螺旋蛋白小得 多而均可通过渗滤或沉淀来移除的肽。随后可收集所得经纯化的重组三螺旋蛋白。这些工 艺均具有浓缩重组三螺旋蛋白的附加优势。重组三螺旋蛋白的沉淀可通过添加硫酸铵、通 过调节pH值和/或调节温度、或通过使用聚合物（例如聚乙二醇）来达到。
[0058] 在另一个实例中，也可通过本领域中已知的方法来从所收集的三螺旋蛋白中移除 污染性宿主细胞核酸。
[0059] 根据三螺旋蛋白的最重用途，可采用所收集的三螺旋蛋白的精制步骤以在已移除 宿主污染物之后立即进一步浓缩和/或纯化所述重组三螺旋蛋白。层析为常用以精制蛋白 溶液的一种此类技术。可采用的层析工艺的实例包括离子交换层析、高效液相层析、电泳、 凝胶过滤层析、亲和层析和疏水性相互作用层析。如果已通过中性聚合物沉淀重组三螺旋 蛋白，则沉淀的盐分将较低，且因此若必需进一步精制纯化，则可直接用于离子交换层析。
[0060] 应了解所述方法促成经纯化的三螺旋蛋白的生成。在一个实例中，经纯化的三螺 旋蛋白为稳定化的。在另一个实例中，三螺旋蛋白通过戊二醛而稳定化；然而，可使用本领 域中已知的其他稳定剂。
[0061] 用于表达重组三螺旋蛋白的合适的宿主细胞包括细菌、酵母或植物细胞。在这些 细胞中重组产生三螺旋蛋白的方法对本领域技术人员而言将为熟悉的。
[0062] 细菌宿主细胞可选自（但不限于）埃希菌属（Escherichia)、芽孢杆菌属 (Bacillus)、肠杆菌属（Enterobacter)、固氮菌属（Azotobacter)、欧文氏菌属（Erwinia)、 假单胞菌属（Pseudomonas)、克雷伯氏氏菌属（Klebsiella)、变形菌属（Proteus)、沙 门氏菌属（Salmonella)、沙雷氏菌属（Serratia)、志贺氏菌属（Shigella)、根瘤菌属 (Rhizobia)、透明颤菌属（Vitreoscilla)和副球菌属（Paracoccus)。在一个实例中，细菌 宿主为大肠杆菌（Escherchia coli)。合适的大肠杆菌（E. coli)宿主包括大肠杆菌BL21 菌株（Life Sciences) \大肠杆菌 W3110 (ATCC27, 325) \大肠杆菌 294 (ATCC31, 446)和大肠 杆菌 X1776(ATCC31, 537)。
[0063]酵母宿主细胞可选自毕赤酵母（Pichia pastoris)、多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha)、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维斯酵母 (Kluyveromyces lactis)、许旺氏酵母（Schwanniomyces occidentis)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、瑞氏木霉（Trichoderma reesei)和耳P氏酉孝母（Yarrowia lipolytica)〇
[0064] 植物宿主细胞可选自烟草、玉米、小麦、大麦，以及诸如微藻的较低等植物，诸如普 通小球藻（Chlorellavulgaris) 〇
[0065] 包含编码根据本公开的方法纯化的重组三螺旋蛋白的核酸序列的表达构建体为 包含编码如本文所定义的重复基序（Gly-X-Y)n的序列的一个表达构建体。通过所述表达 构建体编码的三螺旋蛋白优选为在哺乳动物体温下（即在35°C与40°C之间）热稳定的或 可在通过修饰纯化后变得稳定的。n值可在5至600之间或在1至350之间，且（Gly-X-Y) 表示细菌或动物（哺乳动物）或昆虫来源的三螺旋形成结构域。其中对每个重复单位，X和 Y独立地为任何天然或非天然亚氨基或氨基酸。在一个实例中，X或Y均不为羟脯氨酸。然 而，在一些实例中，三螺旋结构域可包括羟脯氨酸。插入或连接序列可定位于包含超过一个 胶原蛋白状（CL)结构域的构建体中的每个三螺旋形成结构域（在本文中又称为"胶原蛋白 状（CL)形成结构域"）之间，或定位于个别CL结构域内。插入序列由约1至50个任何亚 氨基或氨基酸构成。优选地，插入序列不是酶/蛋白酶不稳定的。
[0066] 在一个实例中，三螺旋蛋白为胶原蛋白。
[0067] 重组三螺旋序列可来源于任何三螺旋蛋白或含有三螺旋的蛋白质，不论其来自细 菌、酵母、植物、昆虫或蚕，且可为羟基化或非羟基化的。
[0068] 如果三螺旋蛋白呈羟基化形式，则在进行本发明的方法之前可采用需要修饰脯氨 酸残基的额外步骤。所述方法对本领域技术人员而言将为熟悉的。
[0069] 编码重组三螺旋状蛋白且可用于设计本发明的适当构建体的实例序列包括：
[0070] ⑴来自病原性或非病原性细菌有机体的序列，其中例如，三螺旋序列可包括来 源于以下各者中的一种或多种的CL结构域：化脓性链球菌（S.pyogenes)、甲基杆菌4-46、 Solibacterusitatus、equiScIC链球菌（StreptococcusequiScIC)、炭疽芽抱杆菌 (Bacillusanthracis)、錯状芽杆菌（Bacilluscereus)、产气荚膜梭菌、沼泽红假单胞菌、 肺炎链球菌A(StreptococcuspneumoniaeA)，其在天然状态中或在通过化学交联稳定化 之后均展现所需热稳定性。序列也可包括在US6, 953, 839中识别的三螺旋胶原蛋白状序 列；
[0071](ii)从选自（但不限于）以下各者的有机体分离的一个或多个DNA序列：白喉 棒状杆菌（Corynebacteriumdiphtheria)、放线菌纲（Actinobacteria)(例如淡黄分枝 杆菌（Mycobacteriumgilvum)、结核分支杆菌（Mycobacteriumtuberculosis)、范巴伦分 支杆菌（Mycobacteriumvanbaalenii)、类诺卡氏菌（Nocardioidesspecies)种、红色 杆菌（Rubrobacterxylanophilus)、栖沙盐水抱菌（Salinisporaarenicola)、热带盐水 抱菌（Salinisporatropica)和链霉菌种、a变形菌纲（Alphaproteobacteria)(例如 边虫（Anaplasma)种、耐幅射性甲基杆菌（Methylobacteriumradiotolerans)、维氏硝 化杆菌（Nitrobacterwinogradskyi)、脱氮副球菌（Paracoccusdenitrificans)、碗豆 根瘤菌（Rhizobiumleguminosarum)、类球红细菌（Rhodobactersphaeroides)、沼泽红假 单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris)、维氏鞘氨醇单胞菌（Sphingomonaswittichii) 和沃尔巴克氏细菌（Wolbachia)种）、拟杆菌门（例如多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron))、0 变形菌纲（Betaproteobacteria)(例如固氮弧菌（Azoarcus) 种、须芒草伯克氏菌（Burkholderiaambifaria)、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia)、结瘤伯克氏菌（Burkholderiaphymatum)、越南伯克氏菌（Burkholderia vietnamiensis)、芳族脱氯单胞菌（Dechloromonasaromatica)、萘降解极地单胞菌 (Polaromonasnaphthalenivorans)、罗尔斯通氏真氧菌（Ralstoniaeutropha)、罗尔斯 通氏贪铜菌（Ralstoniametallidurans)、皮氏罗尔斯通氏菌（Ralstoniapickettii) 和铁还原红育菌（Rhodoferaxferrireducens))、蓝藻菌属（例如蓝杆藻（Cyanothece) 种、集胞藻（Synechocystis)种、红海束毛藻（Trichodesmiumerythraeum))、奇异球菌 属（Deinococcus)(例如抗福射奇异球菌（Deinococcusradiodurans))、（5-变形菌纲 (Deltaproteobacteria)(例如厌氧性细菌（Anaeromyxobacterdehalogenans)、e-变 形菌纲（Epsilonproteobacteria)(例如弯曲杆菌（Campylobactercurvus))、厚壁菌 门（Firmicutes)(例如克劳氏芽孢杆菌（Bacillusclausii)、耐盐芽孢杆菌（Bacillus halodurans)、短小芽抱杆菌（Bacilluspumilus)、枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)、肉 毒芽抱梭菌（Clostridiumbotulinum)、植物发酵梭菌（Clostridiumphytofermentans)、 类肠球菌（Enterococcusfaecalis)、嗜热地芽杆菌（Geobacilluskaustophiius)、干 酷乳杆菌（Lactobacilluscasei)、胚芽乳杆菌（Lactobacillusplantarum)、乳酸乳球 菌（Lactococcuslactis)、球形赖氨酸芽抱杆菌（Lysinibacillussphaericus)、溶血葡 萄球菌（Staphylococcushaemolyticus)、无乳链球菌（Streptococcusagalactiae)和 肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae))、和y-变形菌纲（Gammaproteobacteria) (例如克氏梓檬酸杆菌（Citrobacterkoseri))、肠杆菌种、大肠杆菌、克雷伯氏氏肺炎杆 菌（K1ebsiellapneumoniae)、嗜肺性退伍军人杆菌（Legionellapneumophila)、发光 杆菌（Photorhabdusluminescens)、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa)、嗜虫假 单胞菌（Pseudomonasentomophila)、恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)、嗜冷杆菌 (Psychrobactercryohalolentis)、降解糖菌（Saccharophagusdegradans)、肠道沙门氏 菌（Salmonellaenterica)、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium)、变形斑沙雷氏 菌（Serratiaproteamaculans)、亚马逊希瓦氏菌（Shewanellaamazonensis)、波罗的海希 瓦氏菌（Shewanellabaltica)、冷海希瓦氏菌（Shewanellafrigidimarina)、哈里法克 斯希瓦氏菌（Shewanellahalifaxensis)、光伏希瓦氏菌（Shewanellaloihica)、奥奈达 希瓦氏菌（Shewanellaoneidensis)、匹里那希瓦氏菌（Shewanellapealeana)、腐败希瓦 氏菌（Shewanellaputrefaciens)、沉积希瓦氏菌（Shewanellasediminis)、武氏希瓦氏 菌（Shewanellawoodyi)、鲍氏志贺氏菌（Shigellaboydii)、痢疾志贺氏菌（Shigellad ysenteriae)、弗氏志贺氏菌（Shigellaflexneri)、宋内氏志贺氏菌（Shigellasonnei) 和哈维氏弧菌（Vibrioharveyi));
[0072](iii)为以下各者编码的DNA序列：Clq、乙酰胆碱酯酶、巨噬细胞清道夫受体、肺 表面活性蛋白、甘露糖结合蛋白、冬眠蛋白（hibernationprotein)、足丝贻贝（Mytilus byssus)、外异蛋白A或神经胶质蛋白；
[0073] (iv)编码来源于以下各者中丝叶蜂族膜翅目的锯蜂丝蛋白的序列：在赤杨条纹 叶蜂（Hemichroa)、落叶松叶蜂（Pristiphora)、Pachynemalus、黄头叶蜂（Pikonema)和 叶蜂（Nematus)种（丝角叶蜂（Nematinae)亚科）、桂花叶蜂（Tomostethus)和黑头叶蜂 (Tethida)种（蔺叶蜂（Blennocampinae)亚科）中；以及
[0074] (V)编码包括以下各者中的一种或多种的哺乳动物胶原蛋白的序列型、II型、 III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型、IX型、X型、XI型、XII型、XIII型、XIV型、XV 型、XVI型、XVII型、XVIII型、XIX型、XX型、XXI型、XXII型、XXIII型、XIV型、XXV型、XXVI 型、XXVII型、XXVIII型胶原蛋白。
[0075] 插入序列可在重组构建体中经工程改造以改良三螺旋蛋白的弹性，或以其它方式 充当天然结合域或生物学分裂序列。适合于使用的构建体的实例公开于W0 2010/091251 中。
[0076] 在一个实例中，所表达的三螺旋蛋白和/或其三螺旋结构域为其中相同链经组合 以形成三螺旋的同源三聚体。
[0077] 在另一个实例中，所表达的三螺旋蛋白和/或其三螺旋结构域为由两个或三个经 组合以形成三螺旋的相异链组成，例如在哺乳动物I型胶原蛋白中所见。
[0078] 在另一个实例中，所表达的三螺旋蛋白为包含至少两个借助于连接序列连接的三 螺旋结构域的嵌合蛋白。例如，编码蛋白质的嵌合构建体可包含两个或更多个的哺乳动物 的三螺旋形成结构域和/或可通过接头分隔的细菌三螺旋序列或可通过连接序列分隔的 不同细菌胶原蛋白的三螺旋形成结构域。所述嵌合体在表达时导致产生蛋白质链，所述蛋 白质链能够形成三螺旋且可由以能够形成三螺旋的单一序列接合在一起的两个来源于细 菌的链片段或一个来源于细菌的链片段与来源于哺乳动物的链片段组成。
[0079] 每个三螺旋结构域序列重复可包括之前提及的序列的重复序列、片段、变体或组 合。
[0080] 虽然不限于此，但细菌表达载体可为冷休克载体，并且重组三螺旋蛋白可在低于 37°C的温度下（且在某些实例中在约15°C至23°C的温度下）在微生物（例如大肠杆菌） 中表达。在另一个实例中，表达载体为pET载体（Novagen)。
[0081] 在另一个实例中，选择酵母表达载体。酵母表达载体的实例为本领域中已知的，且 可选自例如PHIL-D2、pPIC3. 5、pHIL-SI、pPIC9、pPICZ、pA0815、pBLADE、pBLARG、Y印Flagl、pAMHllO或pBLURA。
[0082] 在另一个实例中，表达载体为植物表达载体。植物表达载体的实例为本领域中已 知的，且可包括例如PB1121、pCAmbia2301、pEAQ-HT-DEST或PVX表达载体。
[0083] 本公开还提供通过如本文所描述方法来纯化的三螺旋蛋白。
[0084] 本公开还提供通过如本文所描述的方法来获得的经纯化的三螺旋蛋白。
[0085] 在一个实例中，三螺旋蛋白为约80 %、约85 %、约90 %、约95 %、约97 %或约98 % 纯的。
[0086] 已根据本公开的方法经纯化的三螺旋蛋白在需要时可转变成可适用于各种应用 的明胶。将三螺旋蛋白转变成明胶的方法对本领域技术人员而言将为已知的，且通常涉及 例如通过热或化学变性工艺来使蛋白质变性。相应地，本公开还涵盖通过热或化学变性而 转变成明胶的本公开的经纯化三螺旋蛋白。
【附图说明】
[0087] 图1示出根据本发明的一个实施方案的纯化方案的流程图。
[0088] 图2示出宿主蛋白在酸性提取和调节pH值和平衡16小时之后的可溶性。㈧细 菌，大肠杆菌，（B)酵母，啤酒酵母菌，（C)植物，菠菜（Spinaciaoleracea)。
[0089] 图3示出SDSPAGE，所述SDSPAGE展示在酸性沉淀和随后蛋白酶消化之后的三 螺旋蛋白最终纯化；S=蛋白标准物；F=发酵提取物和P=在pH值2. 0沉淀和胃蛋白酶 消化之后的产物，对化脓性链球菌的初始DNA构建体V-CL和V-CL-CL得到沉淀和蛋白水解 CL和CL-CL之后的产物。
[0090] 图4示出化脓性链球菌胶原蛋白海绵和细胞评估，其显示