（A)稳定化薄片（上部） 和海绵（下部），（B)在3小时时的细胞附接，和（C)在16小时之后的细胞活力。
[0091] 序列表的关键词
[0092] SEQ ID NO 1:凝血酶/胰蛋白酶分裂位点
[0093] SEQ ID N0:2:来自化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2片段的DNA序列
[0094] SEQ ID N0:3:来自化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2片段的蛋白序列
[0095] SEQ ID N04:插入序列
[0096] SEQ ID N0 5:正向引物
[0097] SEQ ID N0 6:反向引物
[0098] SEQ ID N0 7:编码来自化脓性链球菌的胶原蛋白的CL结构域的细菌胶原蛋白二 聚体的DNA序列
[0099] SEQ ID N0:8:编码来自化脓性链球菌的胶原蛋白的CL结构域的细菌胶原蛋白二 聚体的蛋白序列
[0100] SEQ ID N09:肝素结合序列
[0101] SEQ ID N0 10:正向引物
[0102] SEQ ID N0 11:反向引物
[0103] SEQ ID N0 12:正向引物
[0104] SEQ ID N013:反向引物
[0105]SEQ ID N014:正向引物
[0106]SEQ ID N0 15:反向引物
[0107] SEQ ID N0 16:编码包括用于肝素结合的经取代功能性序列的来自化脓性链球菌 的细菌胶原蛋白Scl2的DNA序列
[0108]SEQ ID N0 17:编码包括用于肝素结合的经取代功能性序列的来自化脓性链球菌 的细菌胶原蛋白Scl2的蛋白序列
[0109]SEQ ID N0 18:整合素结合序列
[0110]SEQ ID N019:正向引物
[0111]SEQ ID N0 20:反向引物
[0112]SEQ ID N0 21:正向引物
[0113]SEQ ID N0 22:反向引物
[0114] SEQ ID N0 23:编码包括用于整合素结合的经取代功能性序列的来自化脓性链球 菌的细菌胶原蛋白Scl2的DNA序列
[0115]SEQ ID N0 24:编码包括用于整合素结合的经取代功能性序列的来自化脓性链球 菌的细菌胶原蛋白Scl2的蛋白序列
[0116]SEQ ID N0 25:编码包括用于肝素和整合素结合两者的经取代功能性序列的来自 化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2的DNA序列
[0117] SEQ ID N0 26:编码包括用于肝素和整合素结合两者的经取代功能性序列的来自 化脓性链球菌的细菌胶原蛋白Scl2的蛋白序列
[0118] SEQ ID N0 27:使用来自沼泽红假单胞菌的V结构域来编码来自Solibacter usitatus的细菌胶原蛋白的DNA序列
[0119] SEQ ID N0 28:使用来自沼泽红假单胞菌的V结构域来编码来自Solibacter usitatus的细菌胶原蛋白的蛋白序列
[0120] SEQIDNO29:编码来自锯蜂寡斑叶蜂（Nematusoligospilus)基因A的昆虫胶 原蛋白的DNA序列
[0121]SEQIDN0 30:编码来自锯蜂寡斑叶蜂基因A的昆虫胶原蛋白的DNA序列
[0122] SEQIDN0 31:引物
[0123]SEQIDNO 32:引物
[0124]SEQIDNO 33:引物
[0125]SEQIDNO 34:引物
[0126]SEQIDNO 35:引物
[0127]SEQIDNO 36:引物
[0128]SEQIDNO 37:编码人类III型胶原蛋白的片段的3个重复的DNA序列
[0129]SEQIDN0 38:编码人类III型胶原蛋白的片段的3个重复的蛋白序列
[0130]SEQIDN0 39:编码人类I型aI链CB3片段的DNA序列
[0131]SEQIDN0 40:编码人类I型aI链CB3片段的蛋白序列
[0132]SEQIDN0 41:编码由人类胶原蛋白I型和III型链的片段制得的嵌合体的DNA 序列
[0133]SEQIDN0 42:编码其中存在来自甲基杆菌种和S.usitatus的两种不同胶原蛋白 状成分的不同细菌胶原蛋白链的嵌合体的DNA序列
[0134]SEQIDN0 44:编码其中存在来自甲基杆菌种和S.usitatus的两种不同胶原蛋白 状成分的不同细菌胶原蛋白链的嵌合体的DNA序列
[0135] 一般抟术和宙义
[0136] 除非另外具体定义，否则本文所用的所有技术和科学术语将视为具有与一般本领 域技术人员通常理解（例如在细胞培养、分子遗传、重组生物学、真丝技术、免疫学、蛋白质 化学和生物化学中）的含义相同的含义。
[0137] 除非另外指明，否则在本发明中所利用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术为本领 域技术人员所熟知的标准程序。所述技术描述和解释于诸如以下的来源的文献通篇中： J.Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning)，JohnWileyandSons(1984)； J.Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbour LaboratoryPress(1989) ；T.A.Brown(编者），EssentialMolecularBiology:A PracticalApproach，卷 1 和 2,IRLPress(1991) ;D.M.Glover和B.D.Hames(编者）， DNACloning:APracticalApproach，卷 1-4，IRLPress(1995 和 1996);和F.M.Ausubel 等人（编者），CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.Associates和 Wiley_Intersclence(1988 年，包括直至目前的所有更新）；EdHarlow和DavidLane(编 者）Antibodies:ALaboratoryManual，ColdSpringHarbourLaboratory, (1988 年）；和 J.E.Coligan等人（编者）CurrentProtocolsinImmunology，JohnWiley&Sons(包括直 至目前的所有更新）。
[0138]在本说明书通篇中，除非另外具体陈述或上下文另外需要，否则提及单一步骤、物 质组合物、步骤的组或物质组合物的组将视为涵盖这些步骤、物质组合物、步骤的组或物质 组合物的组中的一个和多个（即一种或多种）。因此，如本文所用，除非上下文另外明确指 示，否则单数形式"一种/ 一个（a/an)"和"所述（the)"包括复数方面。例如，提及"一种 / 一个（a) "包括单个以及两个或更多个；提及"一种/ 一个（an) "包括单个以及两个或更 多个；提及"所述（the) "包括单个以及两个或更多个等。
[0139] 除非另外具体陈述，否则本文所描述的本公开的每个实施例可在细节上作必要的 修改之后应用于其他实施例中的每个和全部。
[0140] 本领域技术人员将了解，本文中的公开内容除具体描述的那些外允许进行变型和 修改。应理解本公开包括所有所述变型和修改。本公开还包括在本说明书中单独或共同地 提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，和所述步骤或特征的任何和所有组合或任 何两个或更多个。
[0141] 本公开不限于本文所描述的特定实施例的范围，所述特定实施例仅欲出于范例的 目的。如本文所描述，功能等效的产物、组合物和方法明确处于本发明的范围内。
[0142] 术语"和/或"（例如"X和/或Y"）应理解为表示"X和Y"或"X或Y"，且应视为 提供对两种含义或任一含义的明确支持。此外，在倒数第二和最后特征之间包括词组"和/ 或"的列表或特征表示所列特征中的任何一种或多种可以任何组合形式存在。
[0143] 在本说明书通篇中，词语"包含（comprise) "或变型（comprises/comprising)应 理解为暗示涵盖所陈述的要素、整数或步骤、或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他 元素、整数或步骤、或元素、整数或步骤的组。
[0144] 术语"在非哺乳动物宿主细胞培养提取物或匀浆物内含有"理解为提及从本公开 的宿主细胞制备的细胞培养提取物或匀浆物已由编码三螺旋蛋白序列的构建体转染或转 化。
[0145] 术语"植物"包括整个植物、无性结构（例如叶片、茎、根）、开花器官/结构、种子 (包括胚芽、内胚乳和种衣）、植物组织（例如脉管组织、地面组织和其类似组织）、细胞和其 后代。
[0146] "热稳定"表示三螺旋蛋白（或蛋白质的三螺旋部分）在所给定的温度下维持其三 维结构的程度。根据本发明的方法允许三螺旋结构以所容许的程度不稳定，然而，优选至少 70 %的三螺旋蛋白维持三维三螺旋形式。
[0147] 如本文所用的术语"三螺旋蛋白"理解为提及如本文所描述包含至少一个区（在 本文中根据上下文称为"三螺旋结构域"或"胶原蛋白状结构域"）的同源三聚、嵌合或异源 三聚蛋白质。术语"三螺旋蛋白"还包括如本文所提及的"胶原蛋白状（CL)蛋白"。所述术 语涵盖三螺旋蛋白的变体和片段和其功能等效物和衍生物，其优选均保留至少一个结构或 功能性特征或三螺旋或胶原蛋白状蛋白（即GlyXY)n序列。本公开的三螺旋蛋白理解为 对蛋白水解稳定的。三螺旋蛋白也可包括对经选择用于移除宿主蛋白的蛋白酶酶为蛋白水 解稳定的额外非三螺旋蛋白序列，和/或天然地或通过设计以对所述酶为蛋白水解稳定的 非三螺旋插入序列。
[0148] 如本文所用，术语"胶原蛋白状（CL) "是指多肽包含Gly-X-Y三联体，其中X和Y 可为任何氨基酸。本公开的丝蛋白以及天然产生的细菌胶原蛋白也包括在术语"胶原蛋白 状"内。本公开的胶原蛋白状丝蛋白不具有任何羟脯氨酸。在一个实例中，胶原蛋白状丝蛋 白包含至少约40个，更优选至少约50个Gly-X-Y三联体。此外，在另一个实例中，Gly-X-Y 三联体构成蛋白质的主要氨基酸序列的至少约40%，更优选至少约50%。在另一个实例 中，胶原蛋白状丝多肽具有或在适合的条件下能够形成三螺旋结构。此外，应理解包括在重 组三螺旋蛋白中的任何插入序列或接头均对蛋白酶具有抗性。
[0149] 术语"三螺旋结构域"或"胶原蛋白状结构域"是指包含肽通式（GlyXY)n的蛋 白质，其中Gly为甘氨酸，X和Y表示相同或不同的氨基酸（其具体情况可在不同GlyXY 三联体的范围内变化），其中n可在5与600之间。三螺旋结构域由三个链组成，所述链的 特征在于折置为二螺旋蛋白构象的重复（GlyXY)n基序。
[0150] 如本文所用，术语"三螺旋形成结构域"或"胶原蛋白状形成结构域"是指编码包 含（Gly-X-Y)n基序的氨基酸序列的核苷酸序列，其中X和Y为任何其他氨基酸残基，所述 (Gly-X-Y)n基序能够折叠或与其他两个链缔合以形成三螺旋。
[0151] 术语"同源三聚"是指三螺旋蛋白和/或其三螺旋结构域所含有的三螺旋的所有 三个链均相同。
[0152] 术语"异源三聚"是指三螺旋蛋白和/或其三螺旋结构域含有至少两个不同的形 成三螺旋的链。
[0153] 如本文所用的术语"培养"是指在培养基中繁殖宿主细胞以使之生长和所有继代 培养物。
[0154] 如本文所用的术语"宿主细胞培养提取物"意指其中三螺旋蛋白分泌至培养基中 的宿主细胞培养物。宿主细胞培养提取物可包括例如其中生长有用三螺旋蛋白转化/转染 /转导的宿主细胞的浓缩细胞培养基。如本文所描述，可从所分泌性的三螺旋蛋白中移除或 分离完整宿主细胞。
[0155] 如本文所用的术语"宿主细胞培养匀浆物"意指其中三螺旋蛋白保留在宿主细胞 内且通过破裂或提取工艺而释放的宿主细胞培养物。因此，在本发明的上下文中，匀浆物表 示细胞已经破坏，以使得宿主细胞培养匀浆物包含破裂宿主细胞和已从所述破裂细胞释放 的三螺旋蛋白。
[0156] 如本文所用的术语"构建体"是指含有用于编码三螺旋形成结构域的DNA序列的 表达盒。构建体可还包括V结构域和组氨酸标签。所述术语也延伸至可表达存在于表达盒 中的DNA的载体。DNA在功能上与能够影响其表达的其他序列（例如启动子序列）相关。 一般而言，通常用于重组DNA技术中的表达载体呈"质粒"形式。
[0157] 如本文所用的术语"片段"是指天然氨基酸或核苷酸遗传序列，且具体地三螺旋蛋 白的功能衍生物的一部分。
[0158] 如本文所用的术语"变体"是指缺失、插入或取代有不同核苷酸以产生编码相同或 功能上等效多肽的多核苷酸的序列。
[0159] 术语"纯化"意欲表示通过本文所描述的蛋白质纯化工艺而使三螺旋蛋白变得实 质上不含其他蛋白质（例如特定宿主细胞蛋白）或污染剂。蛋白质可能变得实质上不含其 他蛋白质或污染剂，例如至少约70%或75%或80%或85%或90%或95%或96%或97% 或98 %或99 %不含其他蛋白质或污染剂。
[0160] 发明详述
[0161] 本公开的方法可用于纯化来自非哺乳动物宿主细胞中的任何来源的任何重组产 生的三螺旋蛋白。
[0162] 三螺旋序列
[0163] 适用于本公开的方法的重组三螺旋蛋白序列适用作生物材料、用于制造的材料、 化妆品或食物添加剂。编码三螺旋蛋白的序列由一个或多个三螺旋形成或胶原蛋白状（CL) 形成结构域构成，其中每个CL结构域任选地由非胶原蛋白状抗蛋白酶性插入区分隔。插入 区可适于模拟在许多人类胶原蛋白内发现的三螺旋结构中的天然间断，或可提供所需生物 学功能（例如细胞/组织结合（例如肝素或整合素）、蛋白酶分裂位点等）。插入区可出现 在重组三螺旋序列的个别CL结构域之间或一个CL结构域内。为确保重组蛋白的三螺旋区 的恰当折叠，在翻译之后，球状折叠结构域优选插入在重组构建体的N末端或C末端处。此 球状折叠结构域可在后续蛋白酶消化步骤期间移除。
[0164] 在一个实例中，适用于本公开的方法的三螺旋序列可重组地来源于在病原性或非 病原性细菌有机体中发现的天然三螺旋蛋白。例如，已显示来自化脓性链球菌（Sell或 Scl2)的细菌胶原蛋白状蛋白在不需经翻译后修饰以形成羟脯氨酸的情况下形成稳定三螺 旋结构。在另一个实例中，肠出血性大肠杆菌〇157:H7菌株的基因组序列显示多个具有不 存在于常见实验室菌株K-12中的胶原蛋白状序列的开放阅读框（GhoshN等人（2012)PLoS onee37872)〇
[0165] 可重组产生的天然产生的细菌胶原蛋白状蛋白的替代性来源可在甲基杆菌4-46、 Solibacterusitatus、equiScIC链球菌、炭疽芽孢杆菌、錯状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、沼 泽红假单胞菌、嗜肺性退伍军人杆菌和肺炎链球菌A中找到。相应地，本公开延伸至从这类 来源获得的序列或其片段。
[0166] 在另一个实例中，三螺旋蛋白为包含分隔每个三螺旋结构域的插入序列的重组蛋 白，其中所述插入序列为对蛋白水解稳定的约1至50个亚氨基或氨基酸的非胶原蛋白肽序 列。这些序列提供适用于所得生物材料、化妆品、食物添加剂或其他产品（例如用于生产） 的一些生物学功能。
[0167] 三螺旋蛋白的所需生物学功能可来源于促进三螺旋蛋白与靶向细胞型的结合或 以其他方式在身体中提供用于降解的天然分裂位点的序列。结合序列可包括来自I型胶原 蛋白的整合素结合序列（GERGFPGERGVE)和/或来自乙酰胆碱酯酶的胶原蛋白尾部的肝素 结合序列之一（GRPGKRGKQGQK)。分裂序列可包括（但不限于）基质金属蛋白酶（MMP)结 构域的家族内的一个或多个序列，例如分裂I型、II型和III型胶原蛋白的MMP-I、MMP-2、 MMP-8、MMP-13和MMP-18、以及分裂变性的胶原蛋白的MMP-2和MMP-9。插入序列也可包括 上述结合或分裂序列的部分序列。
[0168] 本公开还涵盖已知达到所述功能的其他序列。所述序列可以4、5、6或8个三肽重 复单元的形式提供，其中最佳分裂可能为（但不限于）5或6个三肽序列。
[0169] 使用重组技术允许引入赋予更大稳定性（诸如电荷对中的变化）的特定稳定三螺 旋基序序列，或影响蛋白质变性温度或JT(Pi)(其随后影响其可用于药物的程度）的序列。
[0170] 功能性结构域可插入在一个三螺旋形成结构域内或在连续三螺旋形成结构域之 间。另外，可添加多