白基因。任选地，基因可进一步就毕赤酵母 表达而优化。基因构建体在大肠杆菌中组装。
[0301] 在适当载体系统PA0815HIS4中结合胶原蛋白基因构建体，以允许使基因构建 体染色体整合至酵母宿主细胞巴斯德毕赤酵母（P.pastoris)中。任选地可使用其他载 体系统，诸如PA0815-SXHIS4、pPIC9HIS4、pPICZZeoR、pPICZaZeoR、pBLADE-IXADEI、 pBLARG-IXARG4、pBLARG-SXARG4或pBLURAURA3。系统的特征在于其中存在强构成性启动 子（GAP)和强诱导性启动子（优选A0XI-醇氧化酶）的甲基营养型表达。添加可用作单独 碳来源的甲醇允许简单完全诱导。此系统使用插入基因的染色体整合，消除在发酵期间连 续选择（例如抗生素）的需要。将包括胶原蛋白基因的载体PA0815与BamHI-起线性化。 线性化质粒通过电穿孔转化至巴斯德毕赤酵母中。各种毕赤酵母菌株（包括GSI15his4) 为合适的。转化体选择为用于表达胶原蛋白构建体的His+细胞。在摇瓶中在pH值为5. 0 的具有甘油的基底盐培养基中生长所选择的细胞。当获得适当的湿细胞密度时，添加甲醇 且再继续发酵72小时。
[0302]实施例17 :使用烟草（Nicotinia)种中的短暂表达、来自S.usitatus的细菌胶原 蛋白片段与来自沼泽红假单朐菌的V结构域的三螺旋蛋白的DNA构律体的表汰
[0303] 使用如实施例4中所描述的编码来自S.usitatus的细菌胶原蛋白CL结构域和 来自沼泽红假单胞菌的V结构域的合成基因，除了序列经优化以用于在烟草种中表达和引 入用于5'AgeI和3'XhoI的限制位点之外。基因经PCR扩增并克隆入pENTRDTOPO中。随 后确认序列的完整性。pENTRDT0P0构建体经BspHI消化且经纯化以移除卡那霉素抗性基 因，因此允许在基因经LRclonase重组入二元pEAQ-HT-DESTGATEWAY目标载体中之后进 行卡那霉素的适当选择（Sainsbury等人（2009)PlantBiotechnolJ7(7):682_93)。二 元质粒转化至根癌土壤杆菌（A.tumefaciens)菌株LBA4404中且维持在其中。构建体在含 有适当抗生素的LB培养基中生长，直至达到生长停滞期。离心培养物，且将小球重悬于包 含10mMMES、10mMMgC12、20mM乙酰丁香酮的渗透培养基中直至0D600为0. 5。在黑暗中 于室温下孵育培养物4小时，随后用注射器渗透至生长至五叶阶段的本生烟草（Nicotiana benthamiana)中（Sainsbury等人（2009)PlantBiotechnolJ7 (7): 682-93)。在渗透 5 天后米集叶片。
[0304] 实施例18-32描述如图1的流程图中所示的本发明的纯化步骤。
[0305]实施例18:伸用声波处理从细菌细朐大肠杆菌提取三螺旋蛋白
[0306] 对提取而言，将来源于例如上文的实施例12-17的各1克细胞浆重悬于20ml 50mM乙酸/HC1缓冲剂（pH2)中，并且使用MisonixS4000仪器，用增强型辅助（Enhance Booster) #1探针，在30A(仪器标度）处，通过声波处理持续5分钟来使细胞破裂。任选地， 通过离心（12, 000xg持续60分钟）来使细胞裂解混合物澄清，并且保留含有三螺旋蛋白 的透明上清液。
[0307]实施例19:伸用弗式压碎器从细菌细朐大肠杆菌提取三螺旋蛋白
[0308] 将来源于例如实施例12-17的冷冻细胞浆解冻且以1:lOw/w与50mM乙酸混合 (pH2)。使此混合物在700巴压力下穿过Apv2000弗氏压碎匀浆器3次，在轮次之间另外冷 却1小时时间段。在加工之后，任选地通过在12, 000xg下离心60分钟来澄清浆液，并且 保留含有经提取的三螺旋蛋白的透明上清液。
[0309]实施例20:从酵母细朐酿酒酵母提取三螺旋蛋白
[0310] 将从酵母表达系统中的任一个获得的细胞浆以每20ml断裂缓冲剂lg细胞浆的 比率重悬于所述缓冲剂（50mM磷酸钠缓冲剂pH7. 4、0. 5mM EDTA、2mM PMSF、5%甘油、0. 1% Triton X-100)中，并且添加相等体积的玻璃珠（Sigma Glass beads#G8772)。随后将混合 物涡旋（140〇rpm)混合物30秒，再静置30秒。再重复涡旋10x次。整个提取过程均保持 在5°C下。随后在10, 000xg下离心混合物1分钟以收集可溶性提取物。
[0311]实施例21:从烟草种的棺物叶片提取三螺旋蛋白
[0312] 将诸如来自实施例17(优选已在-20°C下冷冻）的叶片材料以叶片与缓冲剂 l:10w/w的比放入20mM乙酸钠缓冲剂（pH4. 5)中，且全速在瓦林掺混器（WaringBlender) 中提取。
[0313]实施例22:在表汰和分泌或提取之后验证可溶件三螺旋蛋白
[0314] 通过离心细胞物质、接着进行SDS-PAGE来确立在诸如实施例12-17中的表达和诸 如实施例18-21中的提取后的可溶性三螺旋蛋白或如在实施例16中表达为可溶性产物的 三螺旋蛋白的存在。如果在用于表达的构建体上存在任何标签（诸如His6标签或Flag标 签），则蛋白印迹法可与适当抗体（诸如与辣根过氧化酶结合的单克隆抗聚组氨酸抗体）一 起使用来检测可溶性蛋白质。
[0315]实施例23:诜择用于沉淀细朐提取物的 dH倌
[0316] 如在实施例18-19中那样，以机械方式提取表达宿主细胞，且在所选择的介于pH2 与PH8之间的pH值下孵育提取物。随后任选地移除细胞碎片物质。随后将经提取的细胞 裂解液的样品调节至沉淀pH值（其中以lpH单位间隔或优选地以0. 5pH单位间隔选择各 种pH值），且将样品在4°C下保持16小时。随后通过离心移除沉淀，且通过在280nm处的 吸光度估计上清液的蛋白质含量。如在实施例22中那样，再次确认三螺旋构建体的可溶性 的保持。
[0317]实施例24:在保留可溶件三螺旋蛋白的同时沉淀来自大肠杆菌的表汰细朐宿主 蛋白
[0318] 如实施例1中那样，含有来自化脓性链球菌的可溶性胶原蛋白状蛋白的来自大肠 杆菌的提取蛋白在通过离心提取之后澄清，调节至PH2. 2,在4°C下放置16小时以允许沉 淀。随后以15, 000xg离心样品30分钟，且保留含有三螺旋蛋白的上清液。
[0319]实施例25:在保留来自人类III铟胶原蛋白重复片段的可溶件三螺旋蛋白的同时 沉淀来自酿酒酵母的表汰细朐宿主蛋白
[0320] 使用乙酸或NaOH溶液将含有可溶性三螺旋蛋白的澄清上清液调节至pH5. 0,且在 4°C下放置16小时。通过离心（10, 000xg持续30分钟）移除所得沉淀，且保留上清液。
[0321]实施例26:在保留来自S.usitatus的可溶件三螺旋蛋白的同时沉淀来自烟草种 的表达细胞宿干蛋白
[0322] 使用乙酸或NaOH溶液将含有可溶性三螺旋蛋白的澄清上清液调节至pH4. 5,且在 4°C下放置16小时。通过离心（10, 000xg持续30分钟）移除所得沉淀。随后用乙酸和 HC1调节上清液至pH2. 5,且再放置20小时。通过离心（10, 000xg持续30分钟）来澄清 溶液，且保留上清液。
[0323]实施例27:消化沉淀后残余的可溶件宿主细朐污染物
[0324] 根据以下条件中的任一个调节诸如上述实验中的在移除酸性沉淀的蛋白质之后 所获得的上清液。
[0325] ?pH2. 5,且用胃蛋白酶（0? 01mg/ml)在4°C下持续16小时，随后任选地通过将消 化液的pH值调节至pH7来终止。
[0326].pH6. 5 和NaEDTA(50mM)和半胱氨酸（50mM)，用木瓜蛋白酶（0? 01mg/ml)在 4°C 和pH3. 0下持续16小时，且用真菌酸性蛋白酶XIII型（0. 01mg/ml)在4°C下持续16小时， 且随后任选地通过将消化液的pH值调节至pH7来终止。pH8. 0,且添加胰蛋白酶和胰凝乳 蛋白酶都为〇. 〇lmg/ml，在4°C持续16小时，且随后任选地通过将消化液的pH值调节至pH4 来终止。
[0327] 以下实施例按照本发明的纯化步骤且涉及蛋白质的收集、浓缩和可能的最终精制 和纯化。
[0328]实施例28:通讨硫酸铵沉淀来分离三螺旋蛋白产物
[0329] 将如先前实施例中所论述通过酸性沉淀移除杂质、接着进行蛋白酶处理之后的含 有重组三螺旋蛋白的级分合并，并且将溶液的pH值调节至pH4. 0至7. 0,并经由添加固体硫 酸铵来沉淀三螺旋蛋白。所有步骤均在小于三螺旋的熔化温度的温度下，优选在4°C下进 行。在沉淀必需的固体硫酸铵量之后离心样品，视觉检查沉淀情况，并通过SDS-PAGE分析。 对较小非动物胶原蛋白（诸如来自化脓性链球菌），需要35%饱和硫酸铵。
[0330]实施例29 :通讨聚合物沉淀来分离三螺旋蛋白产物
[0331] 将如先前实验中所论述通过酸性沉淀移除杂质、接着进行蛋白酶处理之后的含有 重组三螺旋蛋白的级分合并，并且将溶液的pH值调节至pH7. 0± 1. 0,并经由添加来自40% 水性储备溶液的聚乙二醇-4000来沉淀三螺旋蛋白。所有步骤均在小于三螺旋的熔化温度 的温度下，优选在4°C下进行。在沉淀必需的聚乙二醇量之后离心样品，视觉检查沉淀情况， 并通过SDS-PAGE分析。对较小非动物胶原蛋白（诸如来自化脓性链球菌），需要10%w/v 聚乙二醇-4000。
[0332] 所获得的蛋白质的纯度显示在图3中。
[0333]实施例30:通讨轺讨滤来分离三螺旋蛋白产物
[0334] 将如先前实施例中所论述通过酸性沉淀移除杂质、接着进行蛋白酶处理之后的 含有重组三螺旋蛋白的级分合并，随后浓缩并使用lOkDa交叉流过滤膜设备（PallLife Sciences)交换至20mM磷酸钠缓冲剂（pH8.0)中。所有步骤均在小于三螺旋的熔化温度的 温度下，优选在4°C下进行。
[0335]实施例31:通讨吸收来分离三螺旋蛋白产物
[0336] 将如先前实施例中所论述通过酸性沉淀移除杂质、接着进行蛋白酶处理之后的 含有重组三螺旋蛋白的级分合并，并且用Tris将溶液的pH值调节至pH8.0±0. 5。对 来自化脓性链球菌的三螺旋蛋白而言，随后将合并的样品吸收到在50mMTris/HCl缓冲 剂（pH8.0)中预平衡的Mono-Q管柱（GEHealthcare)上，所述管柱具有作为带电基团 的-CH2-N+ (CH3) 3。在加料之后，用5管柱体积的平衡缓冲剂洗涤管柱，且随后通过相同缓冲 剂中从0至1M的线性NaCl梯度洗脱。通过214nm处的吸收来检测蛋白质，且通过SDS-PAGE 确认。
[0337]以下实施例说明经纯化的三螺旋蛋白可如何用于临床应用中。
[0338]实施例32 :制诰一制备用于体内应用的细菌胶原蛋白状样品
[0339] 如果经纯化的胶原蛋白要用作生物医学材料，那么它们最有可能需要使用本领域 技术人员已知的方法进一步"精制"。蛋白质还可能需要在用于医学应用中之前稳定化，如 动物胶原蛋白的情况。
[0340] 在此实施例中，通过冷冻干燥化脓性链球菌胶原蛋白（由戊二醛蒸气在封闭式容 器中于20°C下稳定化18小时）来制备海绵。此方法得到在>37°C下稳定的蛋白质海绵。收 缩温度的增加取决于稳定化的程度，但可获得至多~25C的额外稳定性。通过差示扫描量 热法（DSC)，使用PBS中的样品检测稳定化样品的热稳定性。
[0341] 为评估细胞附接，用MEM中的120yg/ml青霉素和200yg/ml链霉素处理经PBS洗 涤的稳定化CL样品2小时，且随后与每样品lx104L929细胞一起接种于96孔培养板中补 充有1 %NEAA和10%FCS的MEM中。在用PBS冲洗样品两次之后3小时和16小时时评估 附接。在37°C下16小时之后用Live/Dead?活力/细胞毒性试剂盒（MolecularProbes) 分析来测试细胞活力。
[0342] 这些数据显示胶原蛋白海绵材料为较小纤维与更大聚集体的混合物。在3小时时 可见L929细胞与较小纤维和聚集体两者的良好附接。在16小时之后，L929细胞在Live/ Dead?分析中显示极佳活力。此时铺展程度非常有限，符合"空白石板"观察结果。GA稳定 化的基质具有少量自体荧光（图4)。
【主权项】
1. 一种用于纯化在非哺乳动物宿主细胞培养提取物或匀浆物内含有的重组表达三螺 旋蛋白的方法，所述方法包括： (i) 在酸性条件下和在所述三螺旋蛋白保持热稳定的温度下从所述三螺旋蛋白沉淀宿 主细胞物质；接着 (ii) 通过添加蛋白酶来消化存在于所述经沉淀的宿主细胞培养提取物或匀浆物中的 宿主细胞物质，其中所述三螺旋蛋白对所述蛋白酶具有抗性；以及 (iii) 收集所述经纯化的三螺旋蛋白； 其中所述三螺旋蛋白在至少步骤（i)和（ii)中均保持可溶。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述三螺旋蛋白在步骤（i)至（iii)中均保持可 溶。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述消化使用酸性蛋白酶来进行。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为细菌、酵母或植物宿 主细胞。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中酸性条件是指pH值小于7。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述沉淀步骤在低于所述三螺旋蛋 白的熔化温度的温度下进行。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其在所述沉淀步骤与所述消化步骤之间 还包括额外的分离步骤，所述分离步骤以物理方式从经沉淀的宿主细胞物质分离所述三螺 旋蛋白。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述中间分离步骤选自离心、过滤、交叉流过滤或 沉降中的一种或多种。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述表达的三螺旋蛋白在所述宿主 细胞内以细胞内方式产生。10. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述表达的三螺旋蛋白是从所述宿 主细胞分泌的。11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括产生含有所述三螺旋蛋白的宿主 细胞培养提取物或匀浆物的额外步骤。12. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在所述重组三螺旋蛋白的 熔化温度（Tm)的温度下进行。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述温度比所述重组三螺旋蛋白的Tm低至少 l〇°C或更多。14. 根据权利要求5所述的方法，其中所述pH值在2与4之间并且所述宿主细胞为细 菌宿主细胞。15. 根据权利要求5所述的方法，其中所述pH值在4与6之间并且所述宿主细胞为酵 母宿主细胞。16. 根据权利要求5所述的方法，其中所述pH值在2与4. 5之间并且所述宿主细胞为 植物宿主细胞。17. 根据权利要求3至16中任一项所述的方法，其中所述三螺旋蛋白对蛋白水解为稳 定的。18. 根据权利要求3至17中任一项所述的方法，其中所述方法相比于对蛋白水解不稳 定的蛋白质，选择性地纯化对蛋白水解稳定的蛋白质。19. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述收集的三螺旋蛋白移除宿主 细胞核酸。20. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述三螺旋蛋白的沉淀通过添加硫 酸铵、通过调节pH值或调节温度和/或通过使用聚合物（例如聚乙二醇）来达到。21. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述收集的三螺旋蛋白通过稳定剂 而稳定化。22. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述三螺旋蛋白包含重复 (Gly-X-Y)n基序，其中n在5与600之间。23. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述三螺旋蛋白为胶原蛋白。24. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述三螺旋蛋白序列来源于细菌性 酵母、植物、昆虫或蚕。25. -种三螺旋蛋白，其通过根据权利要求1至24中任一项所述的方法来纯化。26. -种经纯化的三螺旋蛋白，其通过根据权利要求1至24中任一项所述的方法来获 得。27. 根据权利要求25或26所述的三螺旋蛋白，其通过热或化学变性而转变成明胶。
【专利摘要】本发明涉及一种用于纯化从细菌、酵母或植物宿主细胞重组产生的三螺旋或胶原蛋白状蛋白质的方法。
【IPC分类】C07K1/14, C07K1/30
【公开号】CN105143243
【申请号】CN201480017234
【发明人】约翰·艾伦·莫里斯·拉姆肖, 杰罗姆·安东尼·沃克迈斯特, 彭勇毅
【申请人】国家科学和工业研究组织
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2014年3月21日
【公告号】WO2014146175A1