于一个功能性结构域，其可包括一个三螺旋结构域内的多个重复序列或 跨越若干重复三螺旋结构域（可包括相同或不同功能）的重复序列。类似地，多个功能性 重复序列可包括在三螺旋结构域重复之间，或为可使用序列内和序列之间的插入序列而达 到的更复杂的组合。总之，所有这些方法允许设计和操控所表达的三螺旋蛋白以提供可提 供增强型生物医学产品的特定生物学功能。
[0171] 在另一个实例中，在本公开中还涵盖嵌合三螺旋蛋白。例如，在两个或更多个不同 细菌序列之间、在两个或更多个动物之间或在动物与非动物（例如细菌）序列之间的嵌合 体可容易地通过选择来源于同在载体中的各种同源结构域的特定序列来工程改造，以促成 嵌合三螺旋蛋白的表达。
[0172] 由本发明所涵盖且可重组表达的其他三螺旋蛋白包括Clq、乙酰胆碱酯酶、巨噬细 胞清道夫受体、肺表面活性蛋白、甘露糖结合蛋白、冬眠蛋白、足丝贻贝、外异蛋白A和神经 胶质蛋白、或其片段。
[0173] 宿主细朐
[0174] 根据本公开的宿主细胞为任何便利的非动物细胞，包括细菌、酵母和植物来源的 细胞。本发明的宿主细胞可为能够表达三螺旋或胶原蛋白状蛋白质的天然产生的有机体或 突变有机体。在一个实例中，宿主有机体为已使用重组DNA技术、用编码产生三螺旋蛋白的 异源DNA序列转化的有机体或其后代。
[0175] 三螺旋序列的表汰
[0176] 用于重组三螺旋蛋白的表达构建体可通过本领域已知的任何便利方法引入宿主 细胞中。
[0177] 表达重组三螺旋蛋白的方法包括本领域中一般已知的标准表达方法，诸如描述于 MolecularCloning(Sambrook和Russell(2001))中的那些方法。
[0178] 用于产生三螺旋蛋白的表达系统描述于例如US20120116053中。
[0179] 毕赤酵母的转化、阳性转化体选择和培养方法公开于例如美国专利第4, 837, 148 号；第 4, 855, 231 号；第 4882, 279 号；第 4929, 555 号；第 5, 122, 465 号；第 5, 324, 639 号； 第 5, 593, 859 号和第 6, 472, 171 号中。
[0180] 产生三螺旋蛋白的方法为本领域中已知的且描述于例如US20120282817、 EP1809751 和TO2012/117406 中。
[0181] 用于产生三螺旋蛋白的表达系统描述于例如US20120116053中。
[0182] 所表汰的三螺旋蛋白的回收
[0183] 可通过本领域中已知的技术来采集/收集表达后培养的细胞。在一个实例中，通 过离心来采集细胞且重悬于适合的培养基中以获得发酵液/溶液（即细胞培养提取物）或 匀浆物。
[0184] 回收所表达的重组三螺旋蛋白的确切方法将取决于宿主细胞和表达构建体。在微 生物宿主细胞中，三螺旋蛋白将在宿主细胞的细胞壁内捕获，即使其已被输送至细胞质外 也如此。在此情况下，破坏宿主细胞以回收三螺旋蛋白。或者，可移除或削弱细胞壁以释放 位于胞外质中的蛋白质。破坏可通过本领域中已知的任何手段来实现，包括声波处理、微流 体化、在弗式压碎器或相似设备中裂解、通过与玻璃珠一起剧烈搅拌/研磨来破坏、使渗透 易碎性突变酵母菌株裂解或酶处理。在通过裂解或破坏重组宿主细胞来回收三螺旋蛋白的 情况下，裂解或破坏通常在具有足够离子强度的缓冲剂中进行以允许三螺旋蛋白保持可溶 形式。这些机械和酶破坏方法将产生亚细胞片段，所述片段可通过离心或通过过滤来移除 以获得匀浆物。
[0185] 如果三螺旋蛋白在细胞外（即以可溶性分泌蛋白形式）产生，则仍需要从细胞上 清液移除细胞。澄清一般通过离心来实现，但也可通过沉降和/或过滤来实现。
[0186] 三螺旋蛋白的纯化
[0187] 含有可溶性重组三螺旋蛋白的培养液/溶液（例如细胞培养提取物）或匀浆物随 后根据本公开的方法经受酸性沉淀步骤。这通过添加调整培养液/溶液或匀浆物的pH值 的酸性溶液来达到。酸性溶液可为任何弱酸或强酸或两者的混合物。盐酸、硫酸、乙酸、甲 酸和乳酸均为合适的。不同于用于使胶原蛋白膨胀和溶解的含天然胶原蛋白的哺乳动物组 织材料的预先酸性处理，已发现在本公开的方法中采用的酸化步骤使污染性宿主细胞蛋白 沉淀出来但仍将三螺旋蛋白保持在溶液中。此外，酸化步骤不使三螺旋蛋白变性。因此，所 述方法代表用于从可溶性三螺旋蛋白有效分离宿主细胞污染物的便利工艺。
[0188] 酸性溶液可以浓溶液形式添加。酸化可在4°C的温度下进行，但根据构建体，高达 30°C的温度也是可能的。最适当的温度将取决于已由所选择的核苷酸序列形成的三螺旋蛋 白的熔点温度。使用比三螺旋蛋白的熔点温度（TJ低的温度（优选比Tm低至少10°C或 更多）将确保三螺旋不变性。例如，在pH值2. 2处，构建体长度为234个Gly-Xaa-Yaa基 序的化脓性链球菌的！"为25. 7°C，构建体长度为147个氨基酸的甲基杆菌4-46的Tm为 28. 3°C，构建体长度为189个氨基酸的产气荚膜梭菌的！"为37. 2°C。
[0189] 酸性条件的pH值将根据所选择的宿主系统的情况和用于产生胶原蛋白状蛋白质 的序列的情况而变化。如果使用细菌宿主细胞（诸如大肠杆菌），则pH值优选介于2与3 之间。如果使用酵母宿主细胞，则pH值优选为4至6。如果使用植物宿主细胞，则pH值优 选为2至5。
[0190] 酸性沉淀步骤之后为移除易受蛋白酶消化影响的宿主细胞蛋白的消化步骤。三螺 旋蛋白保持对蛋白酶的抗性。在一个实例中，消化步骤使用酸性蛋白酶来进行。适用于根 据本公开的方法的酸性蛋白酶的实例包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶状酶（诸如 菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶或奇异果蛋白酶）、或佐氏曲霉酸性蛋白酶。根据所采用的蛋白 酶，可必需调节pH条件（例如对诸如木瓜蛋白酶的蛋白酶）。本领域技术人员将熟悉所述 策略。如果使用诸如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的蛋白酶，则可必需将pH值调节至中性或甚 至碱性条件。
[0191] 蛋白酶将许多污染性蛋白质消化为因分子量比完整可溶性重组三螺旋蛋白小得 多而均可通过透滤作用来移除的肽。随后可收集所得重组三螺旋蛋白。借助于透滤作用来 收集具有浓缩重组三螺旋蛋白的附加优势。另外，在某些情况下，可通过使三螺旋蛋白沉 淀，因而使所述三螺旋蛋白移出溶液来促进收集。通过使重组三螺旋蛋白沉淀而收集可通 过添加调节离子强度（使用例如硫酸铵或氯化钠）、通过调节pH值、通过调节温度、或通过 添加聚合物（例如聚乙二醇）来达到。
[0192] 根据在本发明的步骤（i)中所采用的提取方法，在酸性沉淀步骤与蛋白酶消化步 骤之间包括中间分离/纯化步骤可为有益的，所述纯化步骤提供三螺旋蛋白从所沉淀的宿 主细胞物质的物理分离。宿主细胞物质可包括蛋白质和/或DNA。相应地，可采用任何粗分 离工艺以移除这些物质中的一种或两种。所述工艺对本领域技术人员而言将为熟悉的。在 一个实例中，所述工艺包括离心、（超）过滤、交叉流过滤和沉降。
[0193] ||M
[0194] 如果需要将三螺旋蛋白用于医学用途，则优选通过精制纯化来进一步纯化经酸化 和蛋白酶处理的产物，以达到大于90%的纯度。根据本公开，任何精制纯化均为合适的，包 括例如凝胶过滤、疏水性、亲和或离子交换层析。尽管也可使用其他沉淀步骤，但它们一般 达不到所需高纯度。
[0195] 稳宙化
[0196] 如果使用经纯化的三螺旋蛋白作为生物医学材料，则它们必须能够制成适当形 式。三螺旋构建体可形成为海绵和薄片。为帮助达到这些形式，经纯化的三螺旋蛋白可在 用于医学应用中之前稳定化（如动物胶原蛋白的情况），以在需要时改善其长期稳定性和 机械强度。多种多样合适的稳定化策略是可能的。戊二醛是用于交联的合适试剂，且广泛 用于改善胶原蛋白物质的体内稳定性。辐射是另一种物理稳定化技术。
[0197] 根据本公开的方法而纯化的三螺旋蛋白可用于各种应用和程序，包括恢复、再生 和美容程序、血管程序、成骨形成和软骨形成程序、软骨重构、移植骨替代物、止血、伤口处 理和管理、组织强化和支撑、失禁等。
[0198] 可从本发明的重组蛋白聚集产生的生物医学产品的非限制性实例和其可能应用 包括（但不限于）以下方面：可溶性重组胶原蛋白，诸如用于真皮植入物、药物载剂、医学装 置涂层、植入物涂层（骨和血管）、形状形成物质、粘性手术（viscosurgery)、血管封闭剂、 化妆品；海绵状物质，诸如用于三维细胞培养物、组织和器官工程改造、止血剂和伤口治疗 (人工皮肤和伤口涂剂）；纤维，诸如用于手术缝合和止血剂；凝胶状物质，诸如用于组织植 入物、角膜保护膜、隐形眼镜和用于细胞培养的基质；以及膜状物质，诸如用于抗粘附膜、药 物输送系统、人工皮肤和其类似物。
[0199] 本领域技术人员应了解，可在不背离本发明的广泛一般范围的情况下进行上述实 施方案的大量变型和/或修改。因此，本发明的实施方案在所有方面中视为说明性而非限 制性的。 实施例
[0200] 以下实施例1-11描述可根据本文所描述的方法而纯化的不同三螺旋构建体。
[0201] 实施例
[0202] 实施例1 一来自化胺件链球菌的细菌胶原蛋白Scl2片段的DNA
[0203]从国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation) 数据库（NationalinstitutesofHealth，Bethesda，MD20894,美国）中提供的数据获得 用于编码Scl2. 28蛋白的组合球状和胶原蛋白状部分、但缺少C末端附接结构域的scl2. 28 等位基因的片段（Q8RLX7)的DNA序列，作为记录GenBank:AY069936. 1。向此序列中在序 列的N末端处引入His6标签，且在N末端球状结构域（V)与之后的（Gly-Xaa-Yaa) n胶原蛋 白状结构域（CL)序列之间插入凝血酶/胰蛋白酶分裂序列LVPRGSP(SEQIDN〇:l)。在CL 结构域的C末端处包括三联体序列GKY，继而包括终止密码子以及Ndel和BamHI克隆位点。 商业上在不进行任何密码子优化的情况下合成用于此设计的DNA。SEQIDN〇:2为最终构 建体。
[0204]DNA和蛋白序列：（SEQIDNo:2 和 3)
[0205]
[0206]实施例2 :来自化胺件链球菌的胶原蛋白Scl2的CL结构域的细菌胶原蛋白二聚 体的DNA.
[0207] 来自包含球状和胶原蛋白状部分、但缺少C末端附接结构域的化脓性链球菌的 Scl2. 28等位基因的片段的DNA序列如实施例1中所描述。其还包括额外的N末端His6# 签序列、在N末端球状结构域（V)与之后的（Gly-Xaa_Yaa)n胶原蛋白状结构域（CL)序列 之间的凝血酶/胰蛋白酶分裂序列LVPRGSP(SEQIDN0:1)，在CL结构域的C末端处包括三 联体序列GKY，继而包括终止密码子。使用定点突变在CL结构域起点处使用以下寡核苷酸 来在Scl2基因中添加含有插入序列GAAGVM(SEQIDNo:4)的第二构建体：
[0208] 5'ACGCGGTAGTCCCGGGGCAGCGGGTGTTATGGGGCCCAGAGG3' 正向（SEQIDN0:5)
[0209]和
[0210] 3,CCTCTGGGCCCCATAACACCCGCTGCCCCGGGACTACCGCGT5,反向（SEQIDN0:6)
[0211] 随后用5'SmaI(平端）和3'SspI(平端）消化含有GAAGVM插入序列的这个第二 构建体。此经消化的插入序列随后亚克隆回原基因Scl2在原（实施例1)构建体末端的 Smal位点处。最终序列构建体以SEQIDN0:7示出。因为插入序列以平端片段形式克隆， 所以选择菌落，在lxYT中生长，且进行中量制备以选择包括额外的序列和此第二序列正确 定向的克隆。
[0212] DNA和蛋白序列：（SEQIDNo:7 和 8).
[0213]
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[0214]实施例3 :包括用于肝素结合的经取代功能件序列的来自化胺件链球菌的细菌胶 原蛋白Scl2的DNA
[0215] 如实施例1中所给出，使用限制位点5'NdeI和3'BamHI来将Scl2基因克隆入梭形 载体PSL1180中。此克隆随后用于进行定点突变以在序列内引入新结合基序。使用3个依 序定点突变的PCR反应来在Scl2基因的碱基对561处添加肝素结合序列（GRPGKRGKQGQK; SEQIDN〇:9)，因为肝素插入序列为12个氨基酸且围绕插入位点的序列重复极多。对第一 反应，使用以下寡核苷酸：
[0216] 5'TGAAGCTGGTGCTCAAGGCAGGCCGGGTCCAATGGGTCCTGCTG3,正向（SEQIDNo: 10)
[0217]和
[0218] 3'CAGCAGGACCCATTGGACCGGCCTGCCTTGAGCACCAGCTTCA5' 反向（SEQIDNo: 11)
[0219] 对第二反应，使用以下寡核苷酸：
[0220] 5,CAAGGCAGGCCGGGTAAGCGGGGTCCTGCTGGTGAGCG3,正向（SEQIDNo: 12)
[0221] 和
[0222] 3'CGCTCACCAGCAGGACCCCGCTTACCCGGCCTGCCTTG5' 反向（SEQIDN0:13)
[0223] 对第三反应，使用以下寡核苷酸：
[0224] 5,CCGGGTAAGCGGGGTAAACAGGGCCAGAAGGGTGAAAAAGGAGAACCTGG3'（SEQDN0:14)
[0225]和
[0226] 3'CCAGGTTCTCCTTTTTCACCCTTCTGGCCCTGTTTACCCCGCTTACCCGG5'（SEQIDN0:15)
[0227] 用酶Dpnl处理PCR产物以确保所有亲本DNA被消化，且随后转化至大肠杆菌宿主 菌株XLI-BLUE中。最终序列构建体以SEQIDNo16描述。选择菌落，在抗生素选择性培 养基中生长，且进行Qiagen小量制备。鉴别含有所引入的肝素位点的克隆且储存在-20°C 下。
[0228]DNA和蛋白序列：（SEQNo:16 和 17).
[0229]
[0230]实施例4 :包括用于整合素结合的经取代功能件序列的来自化胺件链球菌的细菌 胶原蛋白Scl2的DNA
[0231] 如实施例1中所给出，使用限制位点5'NdeI和3'BamHI来将Scl2基因克隆入 梭形载体PSL1180中。此克隆随后用于进行定点突变以在序列内引入新结合基序。借助 于PCR导引的整合使用两个依序步骤来在Scl2基因的碱基对705处添加整合素结合序列 (GERGFPGERGVE;SEQIDNo: 18)。用于步骤1的寡核苷酸为：
[0232] 5'GGAAAAGATGGTGAACGTGGTTTCCCGGGTCCAGCTGGTAAGGACG3' 正向（SEQIDNo: 19)
[0233]和
[0234] 3'CGTCCTTACCAGCTGGACCCGGGAAACCACGTTCACCATCTTTTCC5'反向（SEQIDNo:20)
[0235] 用于步骤2的寡核苷酸为：
[0236] 5'GAACGTGGTITCCCGGGTGAGAGGGGCGTCGAGGGCCAAAACGGCCAAGAT3' 正向（SEQID No:21)
[0237]和
[0238] 3,ATCTTGGCCGTTTTGGCCCTCGACGCCCCTCTCACCCGGGAAACCACGTTC5，反向（SEQID No:22)
[0239] 用酶Dpnl处理PCR产物以确保所有亲本DNA被消化，且随后转化至大肠杆菌宿主 菌株XLI-BLUE中。最终序列构建体以SEQIDNo23描述。选择菌落，在抗生素选择性培养 基中生长，且进行Qiagen小量制备。鉴别含有所引入的整合素位点的克隆且储存在-20°C 下。
[0240]DNA和蛋白序列：(SEQ_ID_No: 23 和 24)
[0241]
[0242]
[0243]实施例5:包括用于肝素和整合素结合两者的经取代功能件序列的来自化胺件链 球菌的细菌胶原蛋白Scl2的DNA
[0244] 使用如实施例3中所描述的含有引入的肝素结合位点的Scl2基因。使用如实施例 4中所描述的寡...