核苷酸使经选择的含有确定引入的肝素位点的克隆经受第二轮定点突变， 以在Scl2基因的碱基对705处引入整合素结合域（GERGFPGERGVE;SEQIDNo: 18)。用酶 Dpnl处理PCR产物以确保所有亲本DNA被消化，且随后转化至大肠杆菌宿主菌株XLI-BLUE 中。最终序列构建体以SEQIDNo25描述。选择菌落，在抗生素选择性培养基中生长，且 进行Qiagen小量制备。鉴别含有所引入的整合素位点以及肝素结合位点的克隆且储存 在_20C下。
[0245]DNA和蛋白序列：（SEQIDNo:25 和 26)
[0246]
[0247]
CN105143243A 说明书 23/34 页
[0248]实施例6 :使用来自招泽红假单胞菌的V结构域的来自Solibacterusitatus的 细菌胶原蛋白的DNA
[0249]从国家生物技术信息中心数据库（NationalinstitutesofHealth，Bethesda， MD20894，美国）中提供的数据获得用于来自CandidatusSolibacterusitatus Ellin6076的含三螺旋重复序列的胶原蛋白的DNA序列，作为记录ABJ82342。从在国家生 物技术信息中心数据库（NationalinstitutesofHealth，Bethesda，MD20894,美国） 中提供的数据获得用于来自沼泽红假单胞菌V结构域的DNA序列，作为YP_001993084。 将蛋白序列翻译成标称DNA序列，且设计维持正确编码构架的复合基因，其中Met启动 信号后接着是来自S.usitatus的CL结构域，随后为来自沼泽红假单胞菌的V结构域， 最后是C末端His6标签和终止密码子。为5'以Ndel和EcoRI形式添加编码序列外的 末端限制位点，而为3'以Sail和Hindlll形式添加。用在使所需宿主系统大肠杆菌的 表达达到最佳的同时保留原氨基酸序列的DNA序列来合成此构建体（GeneArt?Gene Synthesis,Regensburg,Germany)。最终序列构建体以SEQIDNo:27 描述。
[0250]DNA和蛋白序列：（SEQIDNo:27 和 28)
[0251]
[0252]实施例7 :来自锯蜂寡斑叶蜂基_A的昆虫胶原蛋白的DNA
[0253] 如先前所述（US61/615745)，从所报道的A型链序列（A279)获得来自寡 斑叶蜂丝腺的三螺旋胶原蛋白状实体的DNA。合成基因构建体（Gene Art?Gene Synthesis,Regensburg,Germany)，所述基因构建体包括Ndel和EcoRI限制位点，且引入有 使所需宿主系统大肠杆菌的表达达到最佳的同时保留原氨基酸序列的保守碱基取代。
[0254] 最终序列构建体以SEQNo:29描述。
[0255]DNA和蛋白序列：（SEQIDNo:29 和 30)
[0256]SF21 (A279)-锯蜂胶原蛋白A型基因
[0257]
[0258]实施例8 :用于人类III铟胶原蛋白的片段的3个重复的DNA
[0259]PCR反应的模板是基于cDNACloneMGC:39848(图像 5405119) (ATCC，Manassas，VA)，其含有人类C0L3A1基因且引入有不改变氨基酸序列、但减少次级结 构形成的可能性的有限碱基变化。
[0260] 通过电泳来分离PCR产物，且使用QIAquick凝胶提取试剂盒（Qiagen)来提取所 切除的条带。
[0261] 用于PCR生成三个用于克隆的单独片段的寡核苷酸为：
[0262]
[0263] 使PCR片段经受成对限制酶消化（EcoRI和Xmal、Xmal和BamHI、BamHI和 Sacll，且通过从琼脂糖凝胶提取来纯化片段。与在载体YepFlagl (Eastman Kodak/ IBI，New Haven，CT)中依序接合结合来达到三重复DNA片段的产生。使用适当酶制备载 体DNA。经纯化的PCR片段接合至依序载体构建体中，每个载体构建体的比率为3摩尔 插入序列与1摩尔载体。接合混合物用于使用标准程序来转化大肠杆菌。大肠杆菌菌株 XLlBlue(Stratagene，La Jolla，CA)常规用于质粒的维持、繁殖和转化。若需要则可从此 载体分离单独DNA。最终序列构建体以SEQ ID No:37示出。
[0264] DNA 和蛋白序列：（SEQNo:37 和 38)
[0265]
[0266]实施例9:用于人类I铟a 1链CB3片段的DNA.
[0267] 从国家生物技术信息中心数据库（NationalinstitutesofHealth， BetheSda，MD20894,美国）中提供的数据获得用于人类I型胶原蛋白al链的CB3片段 的DNA序列，作为记录#GenBank:Z74615. 1。通过添加C末端把86标签和终止密码子来修 饰序列，且添加有5'Ndel和3'EcoRI和HindllI限制位点，使构建体适于插入在pColdIV 载体中。由此DNA产生的三螺旋蛋白的稳定性表示所有操作必须在4°C下进行。合成构建 体（0.@ng.Axt儀iGeneSynthesis,Regensburg，Germany)，所述构建体具有在使所需宿主系 统大肠杆菌的表达达到最佳的同时保留原氨基酸序列的保守取代。
[0268] 最终序列构建体以SEQ DD No:39描述
[0269]DNA和蛋白序列：（SEQIDNo:39 和 40)
[0270]
[0271]实施例10 :用于由来自人类胶原蛋白I铟和III铟链的片段制得的嵌合体的DNA
[0272] 在嵌合DNA的产生中使用具有ATCC寄存编号95498的人类胶原蛋白I型a1C-DNA 和具有ATCC寄存编号95502的人类胶原蛋白III型a1C-DNA。
[0273] 最初，使用热休克方法在42°C下将编码胶原蛋白I和III基因的10ngc-DNA转化 至50y1大肠杆菌宿主菌株中。回收对安比西林（ampicillin)具有抗性的菌落且在150ml YT培养基中生长过夜。
[0274] 进行亲本克隆的限制消化，随后在1%琼脂糖凝胶电泳上分析，并且分离和纯化胶 原蛋白条带。使用T4DNA接合酶试剂盒（Invitrogen)来接合载体与经纯化的插入制备物。 随后将接合混合物转化至ToplO细胞中且接种在安比西林选择性培养基上。使用菌落PCR 来检测含有经工程改造的嵌合体的克隆。在1%琼脂糖电泳上分析含有可能工程改造的克 隆的PCR产物。4. 5kb胶原蛋白I基因插入序列使用限制位点Xbal(5'）和Sspl(3'）亚克隆 自其亲本载体PUC19,且使用位点Xbal(5'）和Smal(3'）克隆入细菌梭形载体pBluescript IIKS+(Stratagene)中。此克隆允许胶原蛋白I中碱基对2929-2934处的内部BamHI位点 充当此载体中的独特位点。构造胶原蛋白I(N和C)末端的两个截断。N末端截断含有克隆 入pBluescriptIIKS+中位点Xbal(5'）和BamHI(3'）处的2. 7kb胶原蛋白片段，而大小 为1. 8kb的C末端截断使用限制位点BamHI(5'）和Hindlll(3'）亚克隆入梭形载体pUC19 中。在C末端截断中，使用QuickChangeII定点突变试剂盒（Invitrogen)在C尾肽的碱 基对3706-3711处引入Nael限制位点（静默突变）。在胶原蛋白I终止密码子之后直接添 加HincII位点（GTCAAC)以易于将全长嵌合体克隆入载体系统中。在N末端截断中，使用 PCR来在启动甲硫氨酸残基上游引入kozak序列（kozak序列）。剪接重叠PCR用于使胶原 蛋白la螺旋区与胶原蛋白Ilia螺旋区互换。跨越Collla螺旋的碱基对3288-3711 的重叠与CollIlia螺旋的残基3283-3708的重叠互换。5'重叠寡核苷酸含有所引入的 BamHI位点，而3'寡核苷酸含有所引入的Nael位点。PCR产物使用零平端TOPOPCR克隆试 剂盒（Invitrogen)克隆入pTOPO载体中。将重叠从具有BamHI(5'）和Nael(3'）的pTOPO 消化，且与在PUC19中含有所引入的Nael位点的胶原蛋白I野生型（WT)C末端克隆互换。 使用N末端截断的构建体上的缺失突变来进行N-原肽从胶原蛋白I残基193-609的移除。 随后将基因克隆入胶原蛋白的C末端亚片段中以产生缺少N-原肽的全长基因。最终序列 由SEQNo:41表示。
[0275]DNA序列：SEQIDNo:41
[0276]
[0277]
[0278]实施例11 :用于其中存在来自甲基杆菌种和S.usitatus的两个不同胶原蛋白状 成分的不同细菌胶原蛋白链的嵌合体的DNA
[0279] 从国家生物技术信息中心数据库（NationalinstitutesofHealth， Bethesda，MD20894，美国）中提供的数据获得来自CandidatusSolibacterusitatus Ellin6076和甲基杆菌种的含三螺旋重复序列的胶原蛋白的DNA序列，S.usitatus作为记 录ABJ82342而甲基杆菌作为记录ACA18713. 1。
[0280] 将蛋白序列翻译成标称DNA序列，且设计维持正确编码构架的复合基因，其中Met 启动信号为接着是来自甲基杆菌的V和CL结构域，继而为来自S.usitatus的CL结构域， 最后为终止密码子。为5'以Ndel和EcoRI形式添加编码序列外的末端限制位点，而为 3'以Sail和Hindlll形式添加。此构建体随后就宿主系统中的表达而进行优化，且与在 使所需宿主系统大肠杆菌的表达达到最佳的同时保留原氨基酸序列的DNA序列一起合成 (GeneAlt?GeneSynthesis,Regensburg,Germany) 〇
[0281] 最终序列以SEQIDNo:42描述。
[0282]DNA序列：SEQIDNO42 和 43
[0283]
[0284]
[0285] 实施例12-17描述若干不同构建体的不同表达宿主细胞系统。
[0286]实施例12 :三螺旋蛋白的DNA构律体的表汰.
[0287] 前述例如SEQIDN〇:2、6、14、20、21的DNA构建体中的任一者可克隆入大肠杆菌 中且根据以下方法制得为表达三螺旋蛋白。
[0288] 使用独特位点5'Ndel和3'BamHI来将DNA序列亚克隆入大肠杆菌表达载体系统 pColdlll中。随后使用PCR菌落筛选技术来检测阳性克隆。这些克隆在100ml培养体积中 生长，且进行Qiagen中量制备以扩展载体数量。对表达而言，将所选择的阳性克隆转化入 大肠杆菌宿主BL21-DE3中。在每升含有16g胰化蛋白、10g酵母提取物和5gNaCl的2xYT 培养基中生长细胞（也可在一些情况下使用限定培养基，诸如与SEQIDNo2-起）。所用 的限定培养基（DM)每升含有：KH2P04,10. 6g; (NH4)2HP04,4g;柠檬酸，1. 7g;葡萄糖，25g; MgS04. 7H20,1. 23g;安比西林（50yg/ml)，200mg;盐酸硫胺，4. 4mg;以及痕量盐溶液5mL。 痕量盐溶液每升含有：CuS04. 5H20, 2. 0g;NaI，0? 08g;MnS04.H20, 3. 0g;Na2Mo04. 2H20， 〇? 2g;硼酸，0? ? 02g;CoC12. 6H20,0. 5g;ZnC12,7g;FeS04. 7H20,22g;CaS04. 2H20,0. 5g和 H2S04,lmL。视需要，葡萄糖、镁、痕量盐、硫胺和安比西林在灭菌之后以浓储备溶液的形式 无菌地添加至培养基中。
[0289] 在37°C下生长细胞24小时，且A600处的细胞培养光学密度达到约3-6。培养物 随后在25°C下孵育，且添加ImM异丙基P-D-硫代半乳糖苷（IPTG)以诱导蛋白表达。在 25°C下孵育10小时之后，将温度降低至15°C，再孵育14小时。在孵育24小时之后，通过离 心采集细胞。
[0290] 对于CB3片段的SEQIDNo:31构建体，表达后，将细胞在4°C下保持14小时，且也 在4°C(而非15°C)下进行所有后续加工。
[0291]实施例13 :使用大肠杆菌中的dET载体、来自S. usitatus的细菌胶原蛋白片段与 来自沼泽红假单朐菌的V结构域的三螺旋蛋白的DNA构律体的表汰
[0292] 如实施例6中所描述取得DNA。复合基因使用5'EcoRI和3'HindIII位点克隆入 pET21a载体中。在转化入有效大肠杆菌宿主细胞系BL21DE3之前进行克隆的定序。转化 的细胞接种在YT外加安比西林培养板上且在37°C下生长过夜。从这个培养板选取单一菌 落，且在YT外加安比西林培养基中于37°C下生长过夜。
[0293] 在连接至BiostatB(SartoriusStedimGermany)控制系统的2L搅伴槽生物反 应器中产生重组细菌胶原蛋白。发酵槽中的培养基的初始体积为1.6L，且使用葡萄糖作为 碳来源。向生物反应器中添加一定体积的第二接种培养物以获得初始光学密度0. 25 (在 600nm处测量）。借助于自动添加10% (v/v)聚丙二醇2025来控制发泡；在接种之前添加 3mL消泡剂溶液。pH值设定点为7.0,通过自动添加10% (v/v)H3P04S10% ^八)順3溶液 来控制。溶解氧设定点为饱和的20%，且使用两步级联控制来将溶解氧维持在指定设定点 以上。搅拌器速度介于500rpm至1200rpm的范围内，而气流（补充有5%纯02)介于0. 3L/ min至1. 5L/min的范围内。对高细胞密度补料分批工艺而言，进料溶液由其中添加有40mL 1MMgS047H20的400mL660g/L葡萄糖溶液组成。进料流速为15mL/小时，且在接种8. 5小 时之后开始进料。个别实验的孵育时间和温度根据构建体、宿主细胞系统以及其他情况而 变化。在接种24小时之后，将培养物冷却（经20分钟时间段）至必需温度以活化载体的 冷休克成分和通过添加ImMIPTG(培养物中的最终浓度）来诱导的蛋白质表达。随后通过 离心采集细胞。
[0294]实施例14 :伸用大肠杆菌中的DCold载体、锯蜂丝胶原蛋白的三螺旋蛋白的DNA 构律体的表汰
[0295] 在SEQIDNo: 23的锯蜂DNA分离物中引入限制酶消化位点允许分离锯蜂丝基因 的DNA和将其插入表达载体中。锯蜂胶原蛋白状丝A型基因经由Ndel和EcoRI位点插入 在pColdl载体中。使用PCR菌落筛选技术来检测阳性克隆。这些克隆在100ml培养体积 中生长，且进行Qiagen中量制备以扩展载体数量。对表达而言，将所选择的阳性克隆转化 至有效大肠杆菌BL21细胞中。对锯蜂丝蛋白基因的表达而言，向100ml启动培养基（2x YT-Amp)中添加一个细胞菌落，且在37°C下在200rpm振动的情况下孵育过夜。此培养随后 添加有100ml新制2xYT-2%Glucose-Amp，且用ImMIPTG在25°C下诱导10小时，随后在 2〇°C再持续16小时。通过离心（3000xg持续30分钟）采集细胞浆。蛋白质与细胞小球 缔合。
[0296]实施例15:来自啤酒酵母中III铟胶原蛋白的片段重复的三螺旋蛋白的DNA构律 体的表汰
[0297] 使用诸如实施例8中的DNA/载体（Y印Flagl)，通过在啤酒酵母菌株 BJ5462 (aura3~52trplleu2_lhis3_200pep4::HIS3prb_l. 6R)(YeastGeneticStock Center,Berkeley,CA)中电穿孔来进行酵母转化，其中DNA构建体包含a因子信号a前 导序列/FLAG标签/三个重复胶原蛋白III片段的框架内融合体。将转化体在充气的情况 下于28°C下在SDahl加Ura培养基上生长48小时。在选择之后，将部分在非选择性YPHSM 培养基（1%右旋糖、1%酵母提取物、8%蛋白胨、3%甘油、20mMCaCl2)中稀释且在28°C下 在剧烈振荡下继续生长96小时。通过在12, 000xg下离心20分钟来移除细胞小球。FLAG 的存在提供用于蛋白质鉴别的选项。
[0298] 人类胶原蛋白I型和III型链的DNA构建体的表达可按照相同方法。
[0299]实施例16:伸用毕赤酵母、来自S.usitatus的细菌胶原蛋白片段与来自沼泽红假 单朐菌的V结构域的三螺旋蛋白的DNA构律体的表汰
[0300] 如实施例6中所描述制备细菌胶原蛋