测JC-I和DCF染色结果。含有 高膜电位（A4m)的线粒体被染为红色；低A4m的线粒体被染为绿色（图1)。DCF本身 没有颜色，进入细胞质中W后，与活性氧基团（RO巧结合，呈现绿色巧光（图2)。
[0043] 1. 4流式细胞术分析方法
[0044] 激发波长为488nm，应用前向散射光（KC)和侧向散射光（SSC)设口后，通过巧光 通道化1 (绿）和化2 (红）检测巧光强度，每个样本收集10000个细胞。应用Cell如est 软件获取和分析数据，JC-I组每份样本得到3组数据，分别是红色信号、绿色信号和双信 号，计算红/绿细胞比率和双色信号细胞比率。DCF组每份样本得到一组绿色信号数据，计 算绿色细胞比率。 W45] 1. 5统计学分析
[0046]使用SPSS13.0版本统计软件，每种处理包括20份精子样本，各组间比较采用方 差分析，再进行组间t检验分析，P<0. 05为有显著统计学差异。 阳047] 2.结果
[0048] 2. 1使用线粒体激活剂保护线粒体相对活性
[0049] 使用JC-I染色，对上游法前后、线粒体激活剂诱导及对照组精子进行线粒体功能 分析。结果表明，含有高活性线粒体精子随着获能和上游时间增加而增加，获能前精子相对 线粒体活性为1. 42 ;获能组精子相对线粒体活性上升为6. 23,继续上游1小时，孕酬诱导组 相对活性为12. 33,而线粒体激活剂诱导组精子相对线粒体活性为10. 12 (显著低于孕酬诱 导组）（表1)。
[0050] 2. 2上游精子与线粒体激活剂诱导上游精子内高/低活性线粒体组成变化 阳051] 在同一条精子中，如果含有等量的高A(6111和低A(6111线粒体，称为线粒体活性均 衡的精子。获能前组21. 64%为线粒体活性均衡精子；获能组、孕酬诱导组和线粒体激活剂 诱导组线粒体活性均衡精子比例均显著下降，分别为4. 28%、8. 56%和5. 02%。线粒体激 活剂诱导组的均衡精子比例显著低于孕酬诱导组（表1)。
[0052] 2. 3上游精子与线粒体激活剂诱导上游精子的ROS产量 阳05引 ROS分布于精子的头、颈、尾部（图。。ROS阳性精子比例，获能前组为2. 89%，获 能组显著降低到0. 7%，孕酬诱导组ROS阳性细胞比例为1. 90%，而线粒体激活剂诱导组ROS阳性细胞比例为1. 21 %，与孕酬诱导组没有差别（表1)。
[0054]表1精子获能前后线粒体活性、均衡线粒体和ROS阳性细胞比例比较分析 阳化引
[0056] 注：N= 20。不同的脚标表示组间差异显著（P<0. 01)。
[0057] 2. 4JC-1与DCF染料对精液参数的影响 阳058] 巧光染料JC-I和DCF染色1小时，对精子活力没有影响，染色后精子获能反应正 常。使用JC-I和DCF染色后1小时，精子的总活力和a+b级精子的总数不变。经过两种染 色后的精子，获能后，a+b级运动精子可W达到100% (表2)。
[0059] 表2.精子在染色前后总活力与a+b级精子百分比的变化
[0060]
W61]注：N= 20,P〉0. 05。
[0062] 3.讨论
[0063] 受精精子的特点可W总结为：第一，能够大幅度的提高线粒体功能和正确的 mtDNA拷贝数，高度的mtDNA完整性。超激活精子的线粒体相对活性大约提高了 10倍，消耗 大量的ATP，才能够到达受精地点。第二，低ROS浓度。高ROS可导致精子在受精前的运动 能力已经降低，并且易导致mtDNA及精子DNA出现异常。第三持续保持低潜能线粒体的存 在，提供受精（穿卵）时能量的供应。
[0064]目前体外受精过程中，为了获得较高的受精率，精子与卵子的比例一般保持在 5000~10000:1的水平，远远高于体内的20~200:1的比例，受精时间在18小时左右。通 过降低精子的数量，缩短精卵共同解化的时间，有可能提高临床受孕率和降低流产率。降低 精子数量，则必须提高精子的质量。
[0065] 本研究表明，获能精子在本发明的线粒体激活剂的诱导下，获得的精子不仅在活 动能力上超过获能精子，而且产生的ROS少，精子相对线粒体活性提高，运样的精子更符合 受精精子的特点。如果选择运样的精子直接实施体外受精，则有可能降低所需精子的数量， 同时降低受精所用的时间。
[0066] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可W做出若干改进和补充，运些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种提高精子运动速度的试剂，其特征在于，所述的试剂由以下组分组成：孕酮、N6-Monobutyryladenosine-S' , 5' -cyclic monophosphate 和 Calcium Ionophore A23187,三 者浓度比依次为（10-100 y g/ml) : (I-IOmM) : (I-IOmM)。2. 根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的试剂中三者浓度比依次为 (50-70 y g/ml):(4_6mM):(4_6mM)〇3. 根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述的试剂中三者浓度比依次为（60 y g/ ml):(5mM): (5mM) 〇4. 权利要求1-3任一所述的试剂在制备提高精子运动速度的试剂中的应用。5. 权利要求1-3任一所述的试剂在制备提高体外受精率或胚胎质量的药物中的应用。6. -种提高精子运动速度的方法，其特征在于，包括以下步骤： a) 将精子培养液平铺在液化的精液样本之上，上游0. 8-1. 2小时，然后抽取最上端为 所述精子培养液〇. 5-0. 9倍体积的液体，得到获能精子； b) 向无菌麦管内注满精子培养液，并于顶部添加权利要求1-3任一所述的试剂，然后 将所述无菌麦管的下端插到步骤a)得到的获能精子的上部，上游0. 8-1. 2小时，取出无菌 麦管，收集所述无菌麦管上端3/5-4/5长度的液体； 所述的精子培养液为添加10%人血清白蛋白的HTF培养液。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： a) 将精子培养液平铺在液化的精液样本之上，上游1小时，然后抽取最上端为所述精 子培养液〇. 8倍体积的液体，得到获能精子； b) 向无菌麦管内注满精子培养液，并于顶部添加权利要求1-3任一所述的试剂，然后 将所述无菌麦管的下端插到步骤a)得到的获能精子的上部，上游1小时，取出无菌麦管，收 集所述无菌麦管上端4/5长度的液体。
【专利摘要】本发明涉及一种提高精子运动速度的试剂及方法。所述的试剂由以下组分组成：孕酮、N6-Monobutyryladenosine-3ˊ,5ˊ-cyclic？monophosphate和Calcium？Ionophore？A23187，三者浓度比依次为(10-100μg/ml):(1-10mM):(1-10mM)。所述的方法为：用精子培养液平铺在液化的精液样本上，上游0.8-1.2小时，然后抽取最上端的液体得到获能精子，再向无菌麦管内注满精子培养液，并于顶部添加所述试剂，将无菌麦管插到获能精子的上部，上游0.8-1.2小时，收集上端液体。本发明的方法能够显著提高精子运动速度，为提高体外受精率或胚胎质量提供了理论基础。
【IPC分类】C12N5/076, C12N5/073
【公开号】CN105154392
【申请号】CN201510734470
【发明人】韩毅冰, 张晔, 范宇平, 滕晓明
【申请人】上海市第一妇婴保健院
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年11月3日