一种提高精子运动速度的试剂及方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生殖医学技术领域，具体地说，设及一种提高精子运动速度的试剂及 方法。
【背景技术】
[0002] 虽然人类的睾丸可W利用生精干细胞产生数亿条乃至无限数量的精子，每一次射 精也会射出上百万的精子，可是，运些精子并不是完全相同的。精子间差异表现在精子外包 被的附睾蛋白质差异、细胞核DNA的完整性、线粒体DNA(mtDNA)数量与突变、细胞膜脂类与 糖基的分布、顶体结构完整性等诸多方面。在体内，能够到达受精位置（输卵管壶腹部）的 精子数目只有20~200条左右，只有运一类精子才能最终使卵母细胞受精，而其他大多数 精子的功能在于免疫抑制作用。受精精子具有怎样的分子组成与标记，目前还不清楚。目 前辅助生殖技术中使用的精子分离方法主要是密度梯度离屯、和上游法。使用上游法，可W 提高精子的运动速度，使精子获能，满足正常的体外受精（IV巧要求。
[0003] 辅助生殖技术指采用医疗辅助手段使不育夫妇妊娠的技术，包括人工授精和体外 受精-胚胎移植及其衍生技术两大类。试管婴儿就是使用该技术的体外受精-胚胎移植方 法生育的婴儿。辅助生殖技术使不育夫妇实现妊娠生子的愿望，由不育引发的相关问题自 然会随之得到解决，其还是遏止遗传病的传递，实现优生的重要手段。因此研发提高精子运 动速度的相关试剂和方法，可改进体外受精方法，为提高试管婴儿的质量奠定基础。
[0004] 此外，受精的过程和原理一直是生殖医学中备受关注的研究课题，研究受精精子 的特点对于促进生殖医学的理论发展具有重要意义。
[0005] 然而，目前还未见提高精子运动速度W提高精子受精能力的相关试剂和方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种提高精子运动速度的试剂。
[0007] 本发明的再一的目的是，提供所述试剂的用途。
[0008] 本发明的另一的目的是，提供一种提高精子运动速度的方法。
[0009] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案为：
[0010] 一种提高精子运动速度的试剂，所述的试剂由W下组分组成：孕酬、N6-Monobutyr yladenosine-3'，5'-cyclicmonophosphate和CalciumIonophoreA23187,S者浓度t：t依 次为（10-100yg/ml) : (I-IOmM) : (I-IOmM)。 1] 优选地，所述的试剂中；者浓度比依次为巧0-70yg/mU: (4-6mM) : (4-6mM)。 阳01引更优选地，所述的试剂中S者浓度比依次为（60Jig/ml):巧ml):巧ml)。
[0013] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案为：
[0014] 如上任一所述的试剂在制备提高精子运动速度的试剂中的应用。
[0015] 如上任一所述的试剂在制备提高体外受精率或胚胎质量的药物中的应用。
[0016] 为实现上述第=个目的，本发明采取的技术方案为：
[0017] 一种提高精子运动速度的方法，包括W下步骤：
[0018] a)将精子培养液平铺在液化的精液样本之上，上游0. 8-1. 2小时，然后抽取最上 端为所述精子培养液0. 5-0. 9倍体积的液体，得到获能精子；
[0019] b)向无菌麦管内注满精子培养液，并于顶部添加如上任一所述的提高精子运动速 度的试剂，然后将所述无菌麦管的下端插到步骤a)得到的获能精子的上部，上游0. 8-1. 2 小时，取出无菌麦管，收集所述无菌麦管上端3/5-4/5长度的液体；
[0020] 所述的精子培养液为添加10%人血清白蛋白的HTF培养液。
[0021] 优选地，所述的方法包括W下步骤：
[0022] a)将精子培养液平铺在液化的精液样本之上，上游1小时，然后抽取最上端为所 述精子培养液0. 8倍体积的液体，得到获能精子；
[0023] b)向无菌麦管内注满精子培养液，并于顶部添加如上任一所述的提高精子运动速 度的试剂，然后将所述无菌麦管的下端插到步骤a)得到的获能精子的上部，上游1小时，取 出无菌麦管，收集所述无菌麦管上端4/5长度的液体。
[0024] 本发明优点在于：
[0025] 1、本发明提供了一种能显著提高精子运动速度的试剂，该试剂能够显著提高精子 活力，使之更符合受精精子的特点。
[00%] 2、本发明使用上游法获得获能精子，然后使用线粒体激活剂诱导上游法获得超激 活运动状态的精子，获得的精子不仅在活动能力上超过获能精子，而且产生的ROS少，精子 相对线粒体活性提高，运样的精子更符合受精精子的特点。
[0027] 本发明为改进体外受精方法，提高试管婴儿的质量提供了理论基础。
【附图说明】
[0028] 图1.JC-I染色图片。同一条精子中，同时含有高能和低能线粒体。图C、F显示未 染色精子形态，图A、D显示红色高膜电位线粒体，图B、E显示绿色低膜电位线粒体。 W29] 图2.DCF染色图片。A:R0S特异性染色剂DCF显示，ROS阳性部分（绿色）分布在 精子的头、颈、尾各部分。B:未染色精子。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。 阳0川 实施例1
[0032] 1.对象与方法
[0033]1. 1精液样本选择
[0034] 根据《世界卫生组织人类精液分析实验室技术手册》第五版标准及通过病史询问、 体格检查、精液的病原学检查等，选取精液参数在正常范围，并排除前列腺炎、精索静脉曲 张等相关疾病的样本。选取精液样本20份，年龄范围在30. 8 + 3. 11岁。
[0035]1. 2精液样本处理和实验分组
[0036] 精子培养液为添加10 %人血清白蛋白的HTF培养液（HTF购于化igio公司，商品 号为：ART-1020)。精液液化后，直接使用精子培养液稀释后，为获能前组。上游法使用精 子培养液1毫升，平铺在液化的精液样本之上，上游1小时。抽取最上端的大约0. 8毫升液 体，运时收集的精子为获能精子，为获能后组。使用大约5厘米高的无菌麦管，一端封闭，并 注满精子培养液，在麦管顶部添加/不添加60微升精子趋化试剂线粒体激活剂，将其插到 获能精子样本的上部，再上游1小时。取出麦管，去掉下端1厘米高度的精子培养液，收集 上游1-4厘米高的精子，获得线粒体激活剂诱导精子，为线粒体激活剂诱导组和对照组。
[0037] 其中，所用的线粒体激活剂配方为：
[0038]
[0039]
[0040] 所述的Nb-Monobuty;ryladenosine-3'
，5'-cyclicmono地OS地ate(6-MB-cAMP) Cat.No.:M003,CASNo. : [70253-67-7];所述的CalciumIonophoreA23187CAS No. : [52665-69-7]。
[0041] I. 3JC-1 和DCF染色法
[0042] 将精液样本用Hepes-bufferedHTF培养液洗涂2次后离屯、巧00Xg，5min)。去上 清，得到的精子沉淀用Iml胎pes-bufferedHTF培养液重悬，加入终浓度为50ng/ml的四 氯四乙基苯并咪挫基幾花青舰化物（JC-I)或二氯巧光黄值C巧染料。室溫避光解育15min， 离屯、去染色液，沉淀用预热的化pes-bufferedHTF培养液清洗一次去除多余染料，最后加 入一定量的IXPBS使精子浓度在IXioVml左右，流式检