一种皮肤角质细胞分离、培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种皮肤角质细胞的分离获得方法，尤其涉及一种用于培养获得组织工程表皮的皮肤角质细胞分离、培养方法。
【背景技术】
[0002]皮肤角质细胞培养物在科研、美容产品和医疗领域都有着极其广泛的应用。从表皮和部分真皮层中提取到的具有增殖能力角质细胞，对其进行扩增培养，可以建立活力较高的表皮细胞库。
[0003]在医学领域上，治疗白癜风、烧伤、黑色素瘤、疤痕和妊娠纹等皮肤缺损疾病时，传统的药物治疗或光化学疗法会出现愈后不稳定，需要持续性治疗。而从自身其它部位取皮移植的话又会造成取皮部位皮肤缺损，或出现皮源紧缺的状况。因此可以通过角质细胞培养物来治疗皮肤缺损部位。
[0004]此外，目前美容产品市场非常广阔，相应的其安全性和功效性也变得尤为重要。在投放市场前，可以通过皮肤角质细胞培养物代替人体皮肤来进行敏感度测验及功效性反映。这样既为临床试验提供了方便，同时又减少了试验失败的危害性，林祥梅等人公开的人角质细胞评价化妆品的细胞毒性(毒理学杂质，2008，22 (I):75-76)。
[0005]皮肤角质细胞分离目前有多种方法如Tr法、Tr-C法、Dispase法等，但也常遇见很多问题如:易与其它细胞混杂生长而不能长期生存、活力低、不易贴附、需特殊底物、特殊培养基等。
[0006]皮肤角质细胞的培养方法有滋养层培养法和无滋养层无血清培养法。目前最常用的是滋养层培养法，常采用鼠胚胎瘤的纤维母细胞株3T3细胞经C060照射或丝裂霉素处理失活作为底物，它既能促进细胞贴附又能抑制人成纤维细胞增殖。但3T3可能会产生有害的代谢产物，并且用含牛血清的培养液所培养出的产物用于人体时，易导致排斥反应。
【发明内容】
[0007]针对目前角质细胞分离和培养存在的效率低、具有排异反应等问题，本发明提供了一种角质细胞分离和培养方法。
[0008]本发明第一个方面提供了一种角质细胞的分离方法，包括:
[0009]活性皮肤组织去除黄色脂肪层，保留表皮、和全部或至少部分真皮层；
[0010]活性皮肤组织置于Trypsin/EDTA消化液中进行冷消化；
[0011 ] 添加胰酶终止液，收集表皮组织；
[0012]将收集的表皮组织置于I形胶原蛋白酶中热消化；
[0013]收集细胞悬液。
[0014]本发明第二个方面是提供一种角质细胞的培养方法，包括:
[0015]活性皮肤组织去除黄色脂肪层，保留表皮、和全部或至少部分真皮层；
[0016]活性皮肤组织置于Trypsin/EDTA消化液中进行冷消化；
[0017]添加胰酶终止液，收集表皮组织；
[0018]将收集的表皮组织置于I形胶原蛋白酶中热消化；
[0019]收集细胞悬液，接种培养。
[0020]本发明所述的方法中，所述皮肤组织可以是生物体任意部位的皮肤，例如胸部、腹部、背部、臀部、四肢中的任意一个或几个部位。
[0021 ] 本发明所述的方法中，所述活性皮肤组织冷消化前，还可以进行破碎，形成颗粒。
[0022]本发明所述的方法中，所述皮肤组织中，保留的真皮层厚度优选为0.2_5mm，更优选为0.5-3mm,更优选为l_2mm。
[0023]本发明所述的方法中，所述Trypsin/EDTA消化液浓度优选为0.01-0.2wt %，更优选为0.02-0.1wt %，更优选为0.03-0.08wt %，更优选为0.04-0.07wt %，更优选为0.05-0.06wt % ο
[0024]本发明所述的方法中，所述冷消化温度在2_8°C范围内，更优选为3_6°C范围内，更优选为4-5 °C范围内。
[0025]本发明所述的方法中，所述冷消化时间优选为6-24小时，更优选为8-22小时，更优选为10-20小时，更优选12-18小时，更优选14-16小时。
[0026]本发明所述的方法中，I形胶原蛋白酶浓度优选为0.01% -1 %，更优选为
0.02% -0.8%，更优选为 0.04% -0.7%，更优选为 0.05% -0.5%0
[0027]本发明所述的方法中，所述热消化温度在35-38°C范围内，更优选为36_37.5°C范围，更优选为36.5-37 °C范围。
[0028]本发明所述的方法中，所述热消化时间优选为1-10小时，更优选为2-8小时，更优选为3-6小时。
[0029]其中，所述热消化优选为在搅拌条件下进行。
[0030]本发明所述的方法中，所述接种培养的培养基可以是常规的培养基，本发明中优选为KGM-Gold或DKSFM培养基。
[0031]其中，所述培养基中还可以加入附加因子，如转铁蛋白、胰岛素、激素、表皮生长因子，如氢化可的松、孕酮、转铁蛋白、铁螯合剂中的任意一种或几种。
[0032]其中，KGM-Gold培养基中可添加的附加因子可至少包括氢化可的松(Hydrocortisone)、转铁蛋白(Transferrin)、肾上腺素(Epinephrine)、GA-1000、ΒΡΕ、rhEGF、胰岛素中的任意一种或几种。
[0033]其中，DKSFM培养基中可添加的附加因子可至少包括EGF、盘尼西林(Penicillin)，链霉素(Streptomycin)，两性霉素 B (Amphotericin B)中的任意一种或几种。
[0034]本发明所述的方法中，所述接种过程中，接种细胞密度优选为103-107cellS/ml，更优选为 104_106cells/ml，更优选为(0.2-6) X 105cells/ml，更优选为(0.5-3) X 15Cells/ml，更优选为(1-2) X 105cells/mlo
[0035]本发明所述的方法中，所述培养优选为在无滋养层无血清的情况下进行。
[0036]本发明所述的方法的一种优选实施例中，在所述冷消化前，还包括活性皮肤组织预处理步骤，所述预处理至少包括清洗、消毒中的任意一种或几种。
[0037]其中，所述消毒优选为用碘酒、酒精中的任意一种或几种消毒。
[0038]其中，所述清洗优选为至少采用DPBS清洗。
[0039]其中，所述消毒时间优选为10s-5min，更优选为20s_3min，更优选为30s_lmin，更优选为35s-45s。
[0040]本发明第三个方面是提供一种所述培养方法获得的表皮组织培养物。
[0041]本发明第四个方面是提供一种所述培养方法或所述表皮组织培养物的应用。
[0042]其中，所述应用可以是选自:
[0043]表皮细胞库的建立；
[0044]制备对美容产品进行敏感度测试的材料；
[0045]制备皮肤修复材料。
[0046]所述制备皮肤修复材料中的应用，如用于疤痕修复、妊娠纹的去除、皮肤损伤治疗、以及治疗皮肤疾病中的任意一种或几种的皮肤修复材料。
[0047]其中，所述皮肤疾病包括:色素变化及斑痣类、真菌感染类、病毒感染类皮肤疾病，诸如白癜风、雀斑、白化病、花斑癣、黄褐斑、紫癜、色素痣、太田痣、热激红斑、手癣、足癣、体癣、疱疹、疣等。
[0048]其中，皮肤损伤包括手术创面、晒伤、烧伤、冻伤、擦伤、割伤、溃疡、外伤导致的真皮萎缩中的任意一种或几种。所述手术创面如肿瘤、胎记等切除后的创面。所述溃疡可以包括代谢性疾病如糖尿病足溃疡、放疗和/或化疗后皮肤慢性溃疡、压力性溃疡、静脉溃疡等慢性溃疡。
[0049]其中，所述皮肤修复材料用于植入创面，替代或覆盖病损皮肤。
[0050]本发明具有如下优势:
[0051]I)本发明采用二步消化法，主要提取了基底层和毛囊周围的增殖能力较强的角质细胞，能获得较单一的角质细胞，活力高、易贴壁、易增殖。
[0052]2)本发明方法适合所有的人正常皮肤组织，包括带毛发部位。
[0053]3)本发明方法无需滋养层无需牛血清，可直接铺在预处理过的培养皿或瓶中培养，近似于生理状态的条件培养，消除了异种蛋白的影响。
[0054]4)本发明方法使用的培养基只针对皮肤角质细胞的培养，避免了其它细胞的污染。
[0055]5)本发明方法获得的皮肤角质细胞培养物在科研、美容产品和医疗领域都有着极其广泛的应用。
【附图说明】
[0056]图1为Tr法培养角质细胞结果(A为3天后结果，B为5天后结果)；
[0057]图2为本发明两步消化法培养角质细胞结果(A为3天后结果，B为5天后结果);
[0058]图3为本发明米用胸部皮肤培养角质细胞结果(A为2天后结果，B为5天后结果)；
[0059]图4为本发明采用包皮皮肤培养角质细胞结果(A为2天后结果，B为5天