一种皮肤角质形成细胞的培养基及其培养方法
【专利摘要】本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种皮肤角质形成细胞的培养基及其培养方法。本发明提供的皮肤角质形成细胞的培养基包括DMEM基础培养基，还包括表皮生长因子、转化生长因子、维生素H、重组人胰岛素、转铁蛋白、橙皮苷和白藜芦醇。本发明提供的皮肤角质形成细胞的培养基可以缩短角质形成细胞的贴壁时间，防止角质形成细胞分化和减少角质形成细胞受成纤维细胞的污染；同时该皮肤角质形成细胞培养基还能提高角质形成细胞的增殖率，维持角质形成细胞在传代过程中的活力和细胞特性，是一种较为理想的角质形成细胞体外培养基。
【专利说明】
-种皮肤角质形成细胞的培养基及其培养方法
技术领域
[0001] 本发明属于细胞培养领域，具体设及一种皮肤角质形成细胞的培养基及其培养方 法。
【背景技术】
[0002] 人体的皮肤是由表皮、真皮及皮下组织=部分组成。角质形成细胞是表皮的一种 角质蛋白细胞，是构成表皮的重要组成部分。正常情况下，人体表皮细胞有规律地进行增 殖、分化和脱落，维持着皮肤糖、蛋白质、脂肪、水和电解质的平衡，具有保护自身、调节体 溫、排泄废物和免疫调节等功能。
[0003] 角质形成细胞是表皮细胞的主要组成部分，是一种能合成角质蛋白的上皮细胞。 在角质形成细胞向角质细胞演变的过程中，一般可W分为四层，即基底层、棘层、颗粒层W 及角质层。有人把前=层或前二层称为生发层或马尔匹基层。此外，在某些部位，特别在掌 巧部位，角质层下方还可见到透明层。
[0004] 角质形成细胞的体外培养可W为皮肤毒理学、烧伤治疗学、美容学和皮肤病发病 机制的研究提供了新的途径。但是，皮肤角质形成细胞在分离培养中过程中存在易分化、易 受成纤维细胞污染、不易贴壁等问题，而且角质形成细胞的繁殖力较低、细胞活力较弱，细 胞的成活率不高。因此，建立一种体系稳定、适合于皮肤角质形成细胞细胞生长增殖的培养 方法成为当务之急。
[0005] 张兴等发表了一篇题目为"人皮肤角质形成细胞的制备及体外培养"的论文，该论 文主要探讨了人皮肤角质形成细胞的制备及体外培养，结果显示:膜酶+分离酶消化可获得 较纯的角质形成细胞，细胞在限制性KC-FSM培养基中生长良好，培养4她、72h后测得的D值 显著高于DMEM培养基和RPMI1640培养基。因此，膜酶+分离酶消化、限制性KC-FSM培养基体 外培养是制备和培养人皮肤角质形成细胞的好方法。但是，该限制性KC-FSM培养基在人皮 肤角质形成细胞体外培养过程中仍存在细胞易分化，细胞贴壁时间较长和细胞体外增殖率 较低的缺陷，不利于该方法的推广和应用。
[0006] 中国专利申请201510741542.9公开了一种培养基及其应用与角质形成细胞的培 养方法，所述角质形成细胞的培养基包括KC-FSM无血清基础培养基、KGF、EGF、谷氨酷胺和 非必需氨基酸。采用上述提供的培养基进行培养后，可获得数量大、活力高的角质形成细 胞，细胞特性在传代过程中保持良好，另外该培养基是采用无血清培养基作为基础培养基， 在保证了细胞活力的前提下，避免了异源血清带来的风险。但是，该角质形成细胞的培养方 法在细胞培养过程中存在易氧化、易分化的缺陷，大大的限制了该角质形成细胞的培养方 法的使用。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术中角质形成细胞在体外培养过程中存在细胞易分化、易受成纤 维细胞污染、易氧化、贴壁时间长和细胞增殖率低的缺陷，本发明的目的在于提供一种皮肤 角质形成细胞的培养基及其培养方法，w解决上述问题。
[0008] 本发明提供了一种皮肤角质形成细胞的培养基，包括DMM基础培养基，还包括如 下组分及其浓度:表皮生长因子2-4ng/ml、转化生长因子3-5ng/ml、维生素 H l-3ug/ml、重 组人膜岛素6-9mg/ml、转铁蛋白5-8ug/ml、澄皮巧10-20umol/L和白襲芦醇6-12umol/L。
[0009] 进一步地，所述皮肤角质形成细胞的培养基包括DMM基础培养基，还包括如下组 分及其浓度:表皮生长因子化g/ml、转化生长因子4ng/ml、维生素 H 2ug/ml、重组人膜岛素 8mg/ml、转铁蛋白6ug/ml、澄皮巧16umo 1 /L和白襲芦醇1 Oumo 1 /L。
[0010] 进一步地，所述DMEM基础培养基为高糖型DMEM培养基。
[0011] 进一步地，所述转化生长因子为转化生长因子-0。
[001^ 另外，本发明还提供了一种皮肤角质形成细胞的培养方法，包括W下步骤：
[001引 S1取剪除皮下组织的皮肤组织，剪成0.5cmX 0.5cm的小块放入酶液I中，放置4°C 条件下消化过夜；
[0014] S2将经步骤S1处理后的皮肤组织分离成表皮和真皮，将表皮加入酶液II中剪碎， 放置37°C条件下解育15-20min;
[0015] S3将经步骤S2处理后的表皮吹打6-12次，用200-240目铜网过滤，滤液在1200- 150化/min离屯、，弃上清，得滤渣；
[0016] S4将步骤S3得到的滤渣接入权利要求1-4任一所述的皮肤角质形成细胞的培养基 中，于37°C、5%C〇2的条件下培养5-8天，即得。
[0017]进一步地，所述步骤S1中酶液功质量浓度为0.6-0.8 %的中性蛋白酶溶液。
[001引进一步地，所述步骤S1中酶液功质量浓度为0.7 %的中性蛋白酶溶液。
[0019] 进一步地，所述步骤S2中的酶液II由质量浓度为0.3-0.5%的乙二胺四乙酸和质 量浓度为0.4-0.6 %的膜酶组成。
[0020] 进一步地，所述步骤S2中的酶液II由质量浓度为0.4%的乙二胺四乙酸和质量浓 度为0.5 %的膜酶组成。
[0021] 本发明提供的皮肤角质形成细胞的培养基的组分中，表皮生长因子是一种多功能 的生长因子，促进细胞的生长;转化生长因子-e可W调节细胞生长和分化;维生素 H是细胞 内多种酶的辅酶，在蛋白质合成和物质代谢中起着重要的作用，有利于角质形成细胞的生 长;重组人膜岛素可W提高合成代谢能力，刺激细胞的生长;转铁蛋白是血浆中主要的铁传 递蛋白，为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁。
[0022] 澄皮巧，分子式为C2姐34〇15，CAS号为520-26-3，白襲芦醇，分子式为Ci4出2〇3，CAS号 为501-36-0。澄皮巧和白襲芦醇具有抗氧化作用，有利于维持细胞的生物功能。
[0023] 进一步地，经试验发现，使用本发明提供的皮肤角质形成细胞培养基培养的角质 形成细胞在1化内贴壁，角质形成细胞在1化内呈圆形，继而呈楠圆形，体积变大，2天左右可 见数个角质形成细胞形成小集落，5天左右细胞汇合成片。而且使用本发明提供的皮肤角质 形成细胞培养基培养的角质形成细胞生长旺盛，轮廓清楚，折光性好，成铺路石样形态，培 养初期可见极少量梭形纤维细胞，随着传代和培养时间的延长，成纤维样细胞逐渐消失，可 W获得较高纯度的角质形成细胞。
[0024] 进一步地，经试验发现，与高糖型DMEM培养基相比，使用本发明提供的皮肤角质形 成细胞培养基在4她和72h内可W极显著的（P<0.01)提高角质形成细胞的增殖率，说明本 发明提供的皮肤角质形成细胞的培养基各组分相互协调起促进角质形成细胞增长的作用， 可W有效的提高角质形成细胞的产率。
[0025] 本发明提供的皮肤角质形成细胞的培养基各组分相互协调起缩短角质形成细胞 的贴壁时间，防止角质形成细胞分化和减少角质形成细胞受成纤维细胞污染的作用；同时 该皮肤角质形成细胞培养基还能提高角质形成细胞的增殖率，维持角质形成细胞在传代过 程中的活力和细胞特性，是一种较为理想的角质形成细胞体外培养基。
[0026] 总之，本发明提供的皮肤角质形成细胞的培养基，与现有技术相比具有如下优势：
[0027] 1)本发明提供的皮肤角质形成细胞培养基可W有效的缩短角质形成细胞的贴壁 时间，防止角质形成细胞的分化，减少角质形成细胞受成纤维细胞的污染；
[0028] 2)本发明提供的皮肤角质形成细胞培养基可W有效提高角质形成细胞的增殖率， 维持角质形成细胞在传代过程中的活力和细胞特性，是一种较为理想的角质形成细胞体外 培养基。
【具体实施方式】
[0029] W下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于W下实施例。在本发 明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替 换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。本发明中的各 组分均为常规市售产品，例如:表皮生长因子购于上海恒斐生物科技有限公司，重组人膜岛 素购于上海翊圣生物科技有限公司，中性蛋白酶溶和膜酶购于Sigma公司，DMEM培养基购于 Gibco公司。
[0030] 实施例1、一种皮肤角质形成细胞的培养基
[0031 ]所述皮肤角质形成细胞培养基包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其 浓度:表皮生长因子化g/ml、转化生长因子-防ng/ml、维生素 H lug/ml、重组人膜岛素6mg/ ml、转铁蛋白加 g/ml、澄皮巧10皿ol/L和白襲芦醇6皿ol/L。
[00创制备方法：
[0033] 向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入表皮生长因子、转化生长因子、维生素 H、重 组人膜岛素、转铁蛋白、澄皮巧和白襲芦醇，混匀，过膜除菌即得。
[0034] 实施例2、一种皮肤角质形成细胞的培养基
[0035] 所述皮肤角质形成细胞培养基包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其 浓度:表皮生长因子：3ng/ml、转化生长因子-Mng/ml、维生素 H 2ug/ml、重组人膜岛素8mg/ ml、转铁蛋白6ug/ml、澄皮巧16皿01 /L和白襲芦醇10皿01 /L。
[0036] 制备方法与实施例1类似。
[0037] 实施例3、一种皮肤角质形成细胞的培养基
[003引所述皮肤角质形成细胞培养基包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其 浓度:表皮生长因子4ng/ml、转化生长因子-帖ng/ml、维生素 H 3ug/ml、重组人膜岛素9mg/ ml、转铁蛋白8ug/ml、澄皮巧20皿01/L和白襲芦醇12皿01/L。
[0039] 制备方法与实施例1类似。
[0040] 实施例4、一种皮肤角质形成细胞的培养方法
[0041 ] S1取剪除皮下组织的皮肤组织，剪成0.5cmX 0.5cm的小块放入酶液I中，所述酶液 I为质量浓度为0.7%的中性蛋白酶溶液，放置4°C条件下消化过夜；
[0042] S2将经步骤S1处理后的皮肤组织分离成表皮和真皮，将表皮加入酶液II中剪碎， 所述酶液II由质量浓度为0.4 %的乙二胺四乙酸和质量浓度为0.5 %的膜酶组成，放置37 °C 条件下解育18min;
[0043] S3将经步骤S2处理后的表皮吹打10次，用200目铜网过滤，滤液在1200r/min离屯、， 弃上清，得滤渣；
[0044] S4将步骤S3得到的滤渣接入本发明提供的皮肤角质形成细胞的培养基中，于37 °C、5 % C〇2的条件下培养5-8天，即得。
[0045] 对比例1、一种皮肤角质形成细胞的培养基
[0046] 所述皮肤角质形成细胞培养基包括低糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其 浓度:表皮生长因子：3ng/ml、转化生长因子-Mng/ml、维生素 H 2ug/ml、重组人膜岛素8mg/ ml、转铁蛋白6ug/ml、澄皮巧16皿ol/L和白襲芦醇8皿ol/L。
[0047] 制备方法与实施例1类似。
[0048] 与实施例2的区别在于，基础培养基为低糖型DMEM培养基。
[0049] 对比例2、一种皮肤角质形成细胞的培养基
[0050] 所述皮肤角质形成细胞培养基包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其 浓度:表皮生长因子：3ng/ml、转化生长因子-Mng/ml、维生素 H 2ug/ml、重组人膜岛素8mg/ ml、转铁蛋白6ug/ml和澄皮巧24皿ol/L。
[0051] 制备方法与实施例1类似。
[0052] 与实施例2的区别在于，没有添加白襲芦醇，增加了澄皮巧的浓度。
[0053] 对比例3、一种皮肤角质形成细胞的培养基
[0054] 所述皮肤角质形成细胞培养基包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其 浓度:表皮生长因子：3ng/ml、转化生长因子-Mng/ml、维生素 H 2ug/ml、重组人膜岛素8mg/ ml、转铁蛋白6ug/ml和白襲芦醇24umol/L。
[0055] 制备方法与实施例1类似。
[0056] 与实施例2的区别在于，没有添加澄皮巧，增加了白襲芦醇的浓度。
[0057] 对比例4、一种皮肤角质形成细胞的培养基
[0058] 所述皮肤角质形成细胞的培养基包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及 其浓度：表皮生长因子化g/ml、转化生长因子-Mng/ml、维生素 H 2ug/ml、重组人膜岛素 8mg/ml、转铁蛋白6ug/ml、澄皮巧12umo 1 /L和白襲芦醇12umo 1 /L。
[0059] 制备方法与实施例1类似。
[0060] 实施例2的区别在于，澄皮巧和白襲芦醇的浓度均为12皿ol/L。
[0061 ]试验例一、皮肤角质形成细胞的培养试验
[0062] 1、试验对象:皮肤组织取自健康妇女脱落的子宫内膜。
[00创 2、试验材料:实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4审。 备的皮肤角质形成细胞的培养基。
[0064] 3、试验方法：
[0065] 将脱落的子宫内膜按照实施例4的步骤1-3进行处理，然后把处理后的滤渣放入实 施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的皮肤角质形成细胞 的培养基中，分别标志为实施例1组、实施例2组、实施例3组、对比例1组、对比例2组、对比例 3组和对比例4组，于37°C、5%C02的条件下培养5-8天，
[0066] 并在倒置显微镜下观察细胞的贴壁时间和生长情况。
[0067] 4、试验结果：
[0068] 试验结果如表1所示。
[0069] 表1皮肤角质形成细胞的培养试验
[0072]由表1可知，使用本发明实施例1-3制备的皮肤角质形成细胞的培养基培养的角质形成细胞在1化内贴壁，在1化内细胞呈圆形，继而呈楠圆形，体积变大，2天左右可见数个角质形成细胞形成小集落，5天左右细胞汇合成片。而使用对比例1-4制备的皮肤角质形成细
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[( 胞培养基培养的角质形成细胞的贴壁时间和细胞生长时间均比本发明的实施例1-3的时间 长，说明本发明提供的皮肤角质形成细胞培养基可W有效的缩短角质形成细胞的贴壁时 间，防止角质形成细胞分化和减少角质形成细胞受成纤维细胞污染，是一种较为理想的角 质形成细胞体外培养基。
[0073] 试验例二、皮肤角质形成细胞生长能力测定试验
[0074] 1、试验对象:皮肤组织取自健康妇女脱落的子宫内膜。
[007引 2、试验材料:实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4审。 备的皮肤角质形成细胞的培养基。
[0076] 3、试验方法：
[0077] 3.1、将脱落的子宫内膜按照实施例4的步骤1-3进行处理，然后把处理后的滤渣放 入实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的皮肤角质形成 细胞的培养基，分别标志为对照组、实施例1组、实施例2组、实施例3组、对比例1组、对比例2 组、对比例3组和对比例4组，于37°C、5 % C〇2的条件下培养，W高糖型DMEM基础培养基为对 照组，将原代细胞W相同的剂量接种到96孔板上，每孔的细胞悬液为200ul，细胞数为IX 104个，每种培养基设3个平行孔，分别解育4她、72h;
[0078] 3.2、将^巧容液溶解在0.1111〇1/1的？85中，使其浓度为5旨/1，将培养板的原培养液 弃去，每孔加入200ul培养液，每lOOul培养液中含MTTlOul，将培养板放入培养箱中继续培 养地，然后每孔加入20ul的DMS0中止反应，将培养板放在振荡器上充分混匀，用酶标仪测定 570nm波长时每孔的光密度值(0D值），每组重复3次，取平均值。
[00巧]4、试验结果：
[0080] 试验结果如表2所示。
[0081 ] 表2皮肤角质形成细胞生长能力测定试验(n = 3 +SD)
[0082]
[0083] 注:与对照组相比吁<0.05，*中<0.01。
[0084] 由表2可知，与对照组相比，使用本发明实施例1-3制备的皮肤角质形成细胞的培 养基可W极显著的(P<〇.01)提高角质形成细胞的增殖率，而使用本发明实施例1-4制备的 皮肤角质形成细胞培养基培养的角质形成细胞在4她和72h内的细胞增殖率均比本发明的 实施例1-3的增殖率差，说明本发明提供的皮肤角质形成细胞的培养基各组分相互协调起 促进角质形成细胞增长的作用，可W有效的提高角质形成细胞的产率。
【主权项】
1. 一种皮肤角质形成细胞的培养基，其特征在于，包括DMEM基础培养基，还包括如下组 分及其浓度:表皮生长因子2_4ng/ml、转化生长因子3-5ng/ml、维生素 H l-3ug/ml、重组人 胰岛素6_9mg/ml、转铁蛋白5_8ug/ml、橙皮苷10_20umol/L和白藜芦醇6_12umol/L〇2. 如权利要求1所述的皮肤角质形成细胞的培养基，其特征在于，包括D Μ E Μ基础培养 基，还包括如下组分及其浓度:表皮生长因子3ng/ml、转化生长因子4ng/ml、维生素 H 2ug/ ml、重组人胰岛素8mg/ml、转铁蛋白6ug/ml、橙皮苷16umol/L和白藜芦醇10umol/L〇3. 如权利要求1或2所述的皮肤角质形成细胞的培养基，其特征在于，所述DMEM基础培 养基为高糖型DMEM培养基。4. 如权利要求1或2所述的皮肤角质形成细胞的培养基，其特征在于，所述转化生长因 子为转化生长因子-β。5. -种皮肤角质形成细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤： S1取剪除皮下组织的皮肤组织，剪成0.5cmX0.5cm的小块放入酶液I中，放置4°C条件 下消化过夜； S2将经步骤S1处理后的皮肤组织分离成表皮和真皮，将表皮加入酶液II中剪碎，放置 37°C条件下孵育15-20min; S3将经步骤S2处理后的表皮吹打6-12次，用200-240目铜网过滤，滤液在1200-1500r/ min离心，弃上清，得滤渣； S4将步骤S3得到的滤渣接入权利要求1-4任一所述的皮肤角质形成细胞的培养基中， 于37°C、5%C02的条件下培养5-8天，即得。6. 如权利要求5所述的皮肤角质形成细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S1中酶液 I为质量浓度为〇. 6-0.8 %的中性蛋白酶溶液。7. 如权利要求6所述的皮肤角质形成细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S1中酶液 I为质量浓度为〇. 7 %的中性蛋白酶溶液。8. 如权利要求5所述的皮肤角质形成细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中的酶 液II由质量浓度为〇. 3-0.5 %的乙二胺四乙酸和质量浓度为0.4-0.6 %的胰酶组成。9. 如权利要求8所述的皮肤角质形成细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中的酶 液II由质量浓度为〇. 4 %的乙二胺四乙酸和质量浓度为0.5 %的胰酶组成。
【文档编号】C12N5/071GK106047793SQ201610439563
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】陈松彬, 易萍, 倪彦艳, 张爱萍, 刘杰森
【申请人】广东科玮生物技术股份有限公司