一种适于pk-15细胞生长的低血清无蛋白培养基及其制备方法
【技术领域】
[000。 本发明属于细胞培养领域，具体设及一种适于PK-15细胞生长的低血清无蛋白培 养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002] PK-15系猪肾细胞（PigKi化ey)，体外培养呈上皮样贴壁细胞，该细胞对多种病毒 比较敏感，如猪圆环病毒（PCV)、猪攝病毒（CSFV)、猪细小病毒（PPV)等，可应用于猪圆环病 毒疫苗、猪攝病毒疫苗、猪细小病毒疫苗等的制备。
[0003] 猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV)在分类上属圆环病毒科、圆环病毒属。 PCV不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞，其抗血清不能抑制猪细小病毒（PPV) 对红细胞的凝集性。在临床上主要表现为断奶后仔猪多系统衰弱综合症（Postweaning MultisystemicWastingSyn化ome，PMW巧和猪皮炎与肾炎综合征（PDN巧。除PMWS外， PDNS(猪皮炎与肾病综合征）、PNP(增生性坏死性肺炎）、PRDC(猪呼吸道疾病综合征）、繁 殖障碍、先天性颤抖、肠炎等相关的猪病，死亡率10%~30%不等，较严重的猪场在暴发本 病时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。众所周知，疫苗免疫是防控猪圆环病 毒病的主要手段。
[0004] 猪攝（classicalSWinefever,CS巧是由猪攝病毒（CSFV)引起的一种高度接触 性热性传染病，具有很强的传染性，不同年龄、性别和品种的猪均能感染，而且高致死率，它 的传播必然会对社会经济造成巨大的损失，1984年世界动物卫生组织（01巧将其列入A类 传染病，目前我国也将其定为一类传染病。猪攝除可引起败血症W外，还会引起一系列其它 临床表现，如妊娠母猪流产、胎儿崎变、慢性营养性消耗、淋己细胞和血小板减少等。目前， 世界大部分国家都采取了严格的卫生防疫措施、剔除猪攝感染猪、净化猪群来控制和消灭 猪攝。一些发达国家通过防疫和防控手段已经根除了猪攝，但我国尚未彻底消灭，所W接种 猪攝疫苗尤其重要，也是控制猪攝传播的重要手段之一。
[000引 目前对于PK-15细胞的传统培养方式是贴壁培养，通常在生长及维持培养基中需 要加入10% -20%的动物血清，W提供细胞生长所需的营养成分及细胞保持正常形态的支 持蛋白。该传统工艺效率低、生产成本高；不同血清批次间差异显著；放大重现性较差；对 下游纯化工艺要求高；容易出现血清出复杂成分导致的疫苗质量隐患，设及生物安全和公 共卫生问题。另外，目前全球血清供应趋紧，运大大影响了疫苗企业的生产效率。因此尽量 少用血清已成为PK-15细胞培养的发展趋势，同时低血清与无血清细胞培养技术的研究与 应用已被列入十二五国家科技支撑计划重点项目。
[0006]现有技术常通过添加牛血清白蛋白、转铁蛋白、膜岛素、重组表皮生长因子等动物 源成分W及大豆水解蛋白等植物源蛋白成份，从而来降低血清的使用量。但是上述蛋白质 对生物制品（如疫苗）的安全性有很大影响。
【发明内容】
[0007] 本发明主要提供了一种适于PK-15细胞生长的低血清无蛋白培养基及其制备方 法，具有无蛋白、无动物源成份、化学成份明确几大优点，在科研上可减少血清对实验过程 和结果的干扰，使用本发明所述的培养基，使PK-15细胞的培养过程中是在2%低血清浓度 条件下进行，减少了血清的用量。其技术方案如下：一种适于PK-15细胞生长的低血清无蛋 白培养基，其包括W下组分：
[0008] 氨基酸部分包括W下组分：
[0009] 心天冬氨酸^lSmgZL 以精氨酸盐酸盐50-100mg/L
[0010] L-天冬酷胺：1-15成g/L 心半脫氨酸盐酸盐10-20mg/L 心巧気酸20-50mg/L 心?、^挺漸胺500-1000mgZL 以甘氨酸5-40mg/L 以组氨酸盐酸盐20-50mg/L 心巧巧/安;酸50-150mg/L心巧绩峻50-150mg/L L-蛋氨酸20-50mg/L 心赖氨酸盐酸盐100-200mg/L 以苯丙氨酸沸-lOQmg/L 以脯氨酸10-50mg化 心丝妓酸10-50mg/L 心苏氨酸40-K)0mg/L 以色氨酸5-20mg/LL-酪氨酸20-90mg/L L-娜訪酸 3.0-100mg/L ^内試酸 1-15mg/L 心婷脯氨酸^lOmgZL 以脫氨酸盐酸盐50-100mg化，
[0011] 维生素部分包括W下组分：
[0012] 丙麵酸钢50-150mg/L生物素0.001-0.01mg/L 烟酷胺1-10從g压 硫辛酸0.0001-O.Olmg/L 腐胺 0.001-0,1 ;mg/L 盐酸化唉醇 0.001-0.1.rog/L D-泛酸巧 1 -10mg/L 核巧索O.! -1mg/L 氯化胆碱^lOmgZL 盐酸硫胺1-10mg/L 叶騰 1-10mg/Li-肌醇 10-20mg/L VBll0.001-1mg/L,
[0013] 无机盐部分包括W下组分：
[0014] A：水氣化巧 50-200mgZL 氣化钟 200-500mg/L 硝酸钟0.01-1mg/L 无水硫酸镜10-100mg/L 无水磯酸氨二钢0.]-]0mg/L 无水憐酸二氨納100-200mg/L 氯化销撕蜘-70蜘nig/L 六水氯化儀1 (W㈱mg/L,
[0015] 微量元素部分包括W下组分：
[0016] 八gNO, 化00001-0.0001mg/L 八ICl.; ? 6H:0 0.000] -0.001mg/L Ba(C2l-I:;〇2)2 0.001-0.01mg/L CdSO..; ?8H2O 0.001-0.01mg/L CoCb?6打込O 0.001-0.0!mg/L 打(S〇4)3? ] 5H?_0 化0001 -0.001mg/L CuS〇4?SH.O0.0001-0.001mg/L Fe(NO：〇3? 9HjO 0.00!-().0!mg/L FeS〇4?-HoO 0.001-0.01mg/L GeO] 沿JQ飢-食，㈱Img/L H2SeO.; 0.001-0.0img/L KBi 0.00001-0.0001mg/L KI 0.00001-0.0001mg/L MnCI, ?4H2O 0.0001-0.001mg/L NaF 0.00 !-0.01mglL NajSiO:; ?9H2O 0.01-0.1mg/L NaV〇3 0.0001-0.001mg/L (NH4)6M07024 ?4H2O 0.001-0.01mg/L NiS〇4* 6H.0 化0001-0.001mg/L RbCl 0.000!-0.001ms/L ZnS〇4? 7中0 0.00i-0.01mg/L ZrOCh?8H2O0.001-化01mg/L
[0017] 如樹2 。泪(MBl-O扇Olmg/L TiCL 化00的-化㈱Img/L Na?.SeO,，，5H:0 ".00 ] -0.01mg/L，
[0018] 还包括W下其他组分：
[0019] 胸昔 mg/L 次黄嚷吟 0 01-1mg/L 亚油酸 0.01-1mg/LD-葡萄糖 3000-5000mg/L 齡红 1 -20mg化 HEPES1000-4000mg/L〇
[0020] 优选的，一种适于PK-15细胞生长的低血清无蛋白培养基的组分如下：氨基酸部 分包括W下组分：
[0021] 以天冬氨酸Mmg/L 以精氨酸盐酸盐85mg/L L-天冬醜胺13.5mg/LL-半脫氨酸盐酸盐15.56rag/L心谷氨酸38.5mg/L 心谷氨醜胺舞4mg/L 心甘氨酸35mg/L 以组氨酸盐酸盐47mg/L 心开巧结酸105〇13化 心巧结酸105mg/L 以蛋氨酸39mg/L 以赖氨酸盐酸盐156mg/L 心苯丙氨酸66mg/LL-脯氨酸25mg/L 心丝氨酸42.5mg/L 以苏氨酸％.5mg/L 以色氨酸化mg/L 心酪氨酸71.45mg/L L-鄉氨酸 90.5mg/LL-丙氨酸乂45mg/L 以婷脯氨酸10mg/L 心脫氨酸盐酸益77.62mg化，
[0022] 维生素部分包括W下组分：
[0023] 丙麵酸钥UOmgZL 生物素0.0085mg/L 烟醜胺4.5mg/L 硫辛酸0.0005mg/L
[0024] 腐胺 0.006mg/L 盐酸ft唆醇 0.006mg/L D-泛酸鹤4Jini/L 核黄素〇.565mg/L 氯化胆碱6.8m:g:/L 盐酸硫胺4.17mg/L 叶酸5.65mg/L i-肌醇]0.6mg/LVB12 化0065mg/L，
[00巧]无机盐部分包括W下组分：
[0026] 巧水氯化巧1始.5mg/L 氯化钟3谦名mg/L 硝酸钟0.038mg/L 无水硫酸镜97.67mg/L 无水憐酸氨二钥0.41mg/L 无水憐酸二氨钢108.5mg/L 氯化納5452.5mg/L 六水氯化镑21.5mg化，
[0027] 微量元素部分包括W下组分：
[0028] AgNO'; 0.000065rag/L AlCh? 6H.0 化000964mg/L Ba(QHjC):); 化00462mg/L CdS〇4? 8巿〇 0.0029mg/L C0CI2? 5H,P化00383mg化 Cr(S〇4)3? 15H,0 0.00061mg/L CuSO,?5H.0 化00072mg/L Fe(NC);;):; ?州2〇 化004832mgZL FeSOi? 7H:0 0.0044mg/L 鞠從 化㈱的5ffig化 报诞〇3 0.()055mg/'L KBr 0.000066mg/L
[0029] 魁 化麵脱5孤g/L MnCb* 4山〇 0.00064mg/L NaF 0.0(3507mg/L Na]SiO; * 9H]0 0.064mg/L NaVO:; 0.00076mg/L (NH4、，M化〇24?4H20 0.0056mg/L NiS〇4?食祀O 0.000284mg/L RbCl 0.00036mg/L ZnS〇4? 7H游 0.0043mg/L ZrOC!：. ?8H2O (U)055mg/L SnCU 0.000064mg/L TiCU 0.00077mg/L NcbSeO.i?SH.O 化00865mg/L，
[0030] 还包括W下其他组分：
[0031] 胸昔0.0635rag化 次黄嘿吟0.042rag化 亚油酸 0.042mg/LD-葡萄糖 4500mg/L 齡红i5mg/LHE化S2979mg/L。
[0032] -种适于PK-15细胞生长的低血清无蛋白培养基的制备方法，包括如下步骤：
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