重组腺病毒疫苗株高适应性hek293克隆细胞株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明设及克隆细胞株，尤其设及肥K293克隆细胞株，本发明还设及所述肥K293 克隆细胞株在培养重组腺病毒rAdV-SFV-E2株中的应用，属于肥K293细胞的克隆和应用领 域。
【背景技术】
[0002] 猪攝（Classicalswinefever,CS巧是危害养猪业最严重的传染病之一，被世界 动物卫生组织（01巧列为OIE动物疫病名录，中国将其列为一类传染病。自20世纪50年 代末推广使用猪攝兔化弱毒疫苗W来，有效地控制了CSF在中国大面积爆发和流行。但近 几年，中国猪攝的发病率又呈上升趋势，其流行特点也发生了重大改变，W溫和型猪攝和母 猪持续感染所引起的流产、死胎和新生仔猪死亡等为主，给养猪业造成了严重的经济损失。 猪攝兔化弱毒疫苗存在一些不足，给该病的净化及根除带来了许多困难。首先，现行猪攝弱 毒疫苗的生产工艺存在较多问题，用于生产疫苗的辖牛睾丸细胞和辖牛血清经常污染BVDV 或其抗体，严重影响猪攝疫苗的效价和质量；其次，弱毒疫苗接种时受猪攝母源抗体干扰， 如果免疫程序不当，容易造成免疫失败、先天性感染、隐性感染或免疫耐受。因此，研究一种 安全有效的新型猪攝疫苗是当务之急。
[0003] W活病毒为载体的疫苗，可诱导机体产生针对目的抗原的免疫应答，是一种极具 开发前景的新型疫苗。重组腺病毒可模仿病毒天然的感染方式，并直接在体内表达天然的、 具有生物活性的抗原蛋白，能诱导机体产生有效的特异性体液免疫和细胞免疫应答。近年 来，W重组腺病毒作为载体携带外源基因的新型疫苗研究越来越受到人们的关注。由本发 明人所在团队研制的腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪攝基因工程疫苗rAdV-SFV-E2株， 结合了腺病毒载体高效递送和甲病毒复制子载体高效表达外源基因的功能。该疫苗株高度 安全，且免疫效力与猪攝兔化弱毒疫苗C株相当，并克服了C株疫苗的一些缺陷，如生产工 艺、母源抗体干扰、不同疫苗免疫时相互干扰等。
[0004] 由于复制缺陷型重组腺病毒的增殖需要在可反式提供缺失蛋白的肥K293细胞进 行包装，依靠细胞的生长增殖病毒。
[0005] 因此，从肥K293母本细胞株中筛选获得重组腺病毒rAdV-SFV-E2株高适应性的 肥K293克隆细胞株，对猪攝基因工程疫苗开发和生产均具有重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是从肥K293母本细胞株中克隆得到能够高效培养重 组腺病毒rAdV-SFV-E2株并显著提高病毒滴度的肥K293克隆细胞株。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：
[0008]本发明选择种细胞肥K293,采用有限稀释法进行单细胞克隆，然后选取单个克 隆进一步亚克隆，经2次亚克隆，最终获得4株单克隆细胞株，分别命名为肥K293-D9、 肥K293-B8、肥K293-D10 和肥K293-C4。
[0009] 本发明进一步对肥K293克隆细胞株肥K293-D9、肥K293-B8、肥K293-D10和 肥K293-C4的形态和生长特性进一步研究，并分析其对重组腺病毒rAdV-SFV-E2株的适应 性。
[0010] 生长特性实验结果显示，单细胞克隆株肥K293-D9和肥K293-B8的生长速度明显 快于其它两株细胞及母本细胞。
[0011] 用重组腺病毒rAdV-SFV-E2株感染单克隆细胞株4化后的病毒滴度测定发现，单 克隆细胞株肥K293-D9和肥K293-B8的病毒滴度分别为l(f2和10 8'5TCID5e/mU显著高出 肥K293-D10和肥K293-C4的病毒滴度。
[0012] 单克隆细胞对重组腺病毒rAdV-SFV-E2株的适应性实验结果发现，单克隆细胞株 肥K293-D9和肥K293-B8的适应性远远优于肥K293-D10和肥K293-C4。
[0013] 综上所述，单克隆细胞株肥K293-D9和肥K293-B8在生长速度、病毒的适应性及 稳定性等各方面的性能远远优于其它的肥K293单克隆细胞株；因此，本发明将两株性能优 异的、重组腺病毒rAdV-SFV-E2株高适应性的克隆细胞株肥K293-D9及肥K293-B8提交至 专利认可的机构进行保藏；其中，肥K293单克隆细胞株肥K293-D9的微生物保藏编号为： CGMCCNo. 11097 ;分类命名是：人胚胎肾细胞肥K293 ;保藏时间是：2015年8月12日；保藏 单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、；保藏地址是：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0014] 肥K293单克隆细胞株肥K293-B8的微生物保藏编号为：CGMCCNo. 11096;分类命 名是：人胚胎肾细胞肥K293;保藏时间是：2015年8月12日；保藏单位是：中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中屯、；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所。
[0015] 本发明所提供的两株性能优异的、重组腺病毒rAdV-SFV-E2株高适应性的肥K293 克隆细胞株肥K293-D9和肥K293-B8能够高效增殖病毒，显著提高病毒滴度，在重组腺病毒 rAdV-SFV-E2株的生产中应用潜力尤为巨大。
[0016] 由此，本发明公开了所述应用所述肥K293克隆细胞株肥K293-D9和肥K293-B8在 培养病毒中的应用，包括W下步骤：
[0017] (1)培养权利要求1或2所述的肥K293克隆细胞株至单细胞层；（2)接种病毒株 进行培养；（3)收获病毒液。
[0018] 本发明进一步考察了应用肥K293克隆细胞株肥K293-D9培养重组腺病毒疫苗株 的各项参数，实验结果发现，在病毒接种剂量、收获病毒液的时间W及病毒株的吸附时间等 参数对于病毒液的效价均能产生显著的影响。
[0019] 本发明发现，在接种病毒rAdV-SFV-E2株时，按照接种剂量MOI= 0. 1加入病毒， 能获得较高效价的病毒液，其效价最高达到108'5±°'2TCID日。/mL;按照接种剂量MOI= 0. 1加 入病毒时，在病毒感染后24~3化收获病毒液，其效价达到最高~1〇s'4±°'2TCIDw/ mL)，其中，在病毒感染后3化收获病毒液，其效价达到最高（l(f4±°'2TCIDw/mL)，超过3化收 获病毒液，效价呈急骤下降态势。
[0020] 按照MOI= 0. 1接种病毒，吸附0. 5-比后补加病毒维持液，能够明显提升病毒滴 度，其中，吸附Ih后再补加病毒维持液，病毒效价达到最高（l〇s'6±°'2TCIDw/mL);为了有效 提升病毒液的滴度，本发明优选在接种病毒后吸附Ih后补加病毒维持液，再继续进行培 养。
[0021] 本发明通过实验还发现，无血清的病毒维持液与含1%牛血清的病毒维持液无显 著差异，考虑成本，因此本发明优选采用无血清的病毒维持液。
[0022] 所述的病毒包括腺病毒（Adenovirus)或慢病毒化entivirus);优选的，所述腺病 毒包括重组腺病毒或其他血清型腺病毒；所述重组腺病毒为重组5型人腺病毒；所述病毒 株为重组腺病毒株，优选为重组腺病毒rAdV-SFV-E2株。
[0023] 本发明技术方案与现有技术相比，具有W下有益效果：
[0024] 本发明从肥K293母本细胞株中克隆得到了 2株性能优异的肥K293克隆细胞株 肥K293-D9和肥K293-B8,重组腺病毒rAdV-SFV-E2株在两株细胞克隆株中能够高效增殖， 并获得较高效价的病毒液，其毒价不低于l〇8'°TCIDw/mU与肥K293母本细胞培养的病毒相 比，病毒滴度提高了 10倍左右，在猪攝基因工程疫苗的生产中有较高的应用价值。
[00巧]本发巧所徙及到的术语定女
[0026] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0027] 术语"单细胞克隆"意指将一个细胞进行培养，使之不断分裂，形成一个细胞群的 过程，运一群细胞来源于一个共同的祖先细胞。
[0028] 术语"亚克隆"意指在细胞克隆中，对培养的细胞，从原有的克隆中再筛选出具有 某种特性的细胞进行培养。
[0029] 术语"传代"意指当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营 养液的过程，否则将影响细胞的继续生存。
【附图说明】
[0030] 图1四株单克隆细胞株的细胞形态：其中，A:肥K293-D10 ;B出EK293-C4;C: 肥K293-D9;D:肥K293-B8 ;
[0031] 图2肥K293单克隆细胞株的生长曲线测定结果；
[0032] 图3单克隆细胞对重组腺病毒rAdV-SFV-E2株的适应性实验结果（*p<0. 05)。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可W对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但运些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0034] 1、实验材料
[0035] 毒株：重组腺病毒载体猪攝基因工程疫苗rAdV-SFV-E2株，由中国农业科学院哈 尔滨兽医研究所猪烈性传染病创新团队构建、鉴定和保存。肥K293细胞购于美国菌种保藏 中屯、（ATCC)。
[0036] 实施例1肥K293克隆细胞株的克隆及鉴定
[0037] 1实验方法
[0038] 1. 1肥K293克隆细胞株的克隆
[0039] (I)选择种细胞肥K293;
[0040] 似细胞传代：首先复苏步骤（1)所选择的种细胞到T25(Corning)的细胞瓶中， 培养3化左右，按照1:4的比例进行传代，克隆前连续传代10次；
[0041] (3)采用有限稀释法在96孔板内进行肥K293单细胞克隆，消化后的肥K293细胞 计数后稀释到1个细胞/mU将稀释好的细胞铺于96孔板，0.ImL/孔，37°C5%C〇2培养箱 内培养，观察10日；
[0042] (4)选取单个克隆进一步亚克隆，经2次亚克隆，选取单克隆株进行扩大培养，培 养液为DMEM(含10%FB巧，并对克隆细胞进行进一步鉴定。
[0043]