一种用于病毒分离培养和增殖的细胞株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于畜牧类生物技术领域，更具体的讲是一种用于病毒培养和增殖的细胞 株。
【背景技术】
[0002] 传代细胞应用于疫苗生产，经过多年的研究与尝试，排除了致肿瘤性等不安全因 素，终于在1984年得到了国际上的普遍承认。在传代细胞系中，运用最广泛的是Vero细胞 (非洲绿猴肾细胞），流感病毒，狂犬病毒，乙型脑炎病毒等病毒疫苗均可W使用Vero细胞 进行生产，同时该细胞也是肠道病毒71，脑脊髓炎病毒等病毒疫苗生产的候选细胞。
[0003] 在畜禽用病毒疫苗的生产中，仍然有很大一部分疫苗是利用动物组织、禽胚或是 原代细胞进行生产，其制造工艺复杂落后，生产成本过高，生产效率低下，同时生产所用的 动物组织等原材料来源、品种不一致使疫苗质量不稳定，并且还存在携带其他病原的潜在 危险。因此寻找适用于畜禽病毒增殖的安全、稳定、高效传代细胞系对疫苗生产具有重要的 现实意义。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种用于畜禽类病毒增 殖的细胞株，该细胞株对于多种畜禽病毒敏感且稳定，并能持续稳定增殖，该细胞株无支 原体、细菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在致瘤风险，安全性高。 阳〇化]本发明是通过W下技术方案实现的： 本发明提供了一种用于畜禽病毒培养的细胞株，其中，细胞株为非洲绿猴肾细胞系VeroBlO株（AfricangreenmonkeykidneycelllinestrainVeroBlO),其保藏编号 为：CGMCCNo. 9705,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏日期为 2014年09月24日。
[0006] 本发明中，所用术语"非洲绿猴肾细胞系VeroBlO株"是指从非洲绿猴肾细胞系 Vero母细胞克隆获得的新细胞株，也称为VeroBlO细胞，简称VeroBlOo
[0007] 本发明中，所述非洲绿猴肾细胞系VeroBlO株具有W下特征：细胞贴壁良好、形态 饱满、界限清晰，表面光滑，VeroBlO株较Vero母细胞细胞之间的界限更明显、整齐，细胞折 光性强，胞质饱满，核质清晰。
[0008] 本发明所述的一种用于病毒分离培养和增值的细胞株的选育方法，其包括如下步 骤： Vero细胞有限稀释法克隆培养和病毒敏感Vero细胞株的筛选。
[0009] 具体步骤为： (1)Vero细胞有限稀释法克隆培养 将Vero细胞传代第5代，经检验无支原体、细菌、真菌、外源病毒污染后，用0. 25%膜蛋 白酶消化制成单细胞悬液，细胞计数后用含8%胎牛血清的DMEM培养基进行连续梯度稀释， 然后接种于96孔细胞培养板，加入于37°C5%C02培养箱培养15d，挑选有单个细胞生长 的细胞孔中的细胞转入24孔板培养，并依次将细胞扩大培养，获得亚克隆细胞株。
[0010] (2)病毒敏感Vero细胞株的筛选 挑选细胞状态好的几株亚克隆细胞分别接种于96孔细胞培养板内，待细胞长满单层， 使用山羊痘病毒AV41株进行接种，于37°C5%C02培养箱培养，观察细胞病变，并W未接 毒的细胞作为阴性对照，挑选病变最明显的Vero细胞株进行传代，经=次连续筛选后，获 得1株敏感性最高的细胞克隆株，命名为VeroBlO株，即非洲绿猴肾细胞系VeroBlO株，并 用液氮保存。
[0011] 根据本发明的非洲绿猴肾细胞系VeroBlO株形态均一，生长性能好，生长曲线呈 "S"型，细胞形态和生长速度稳定，生长周期长，可连续传代，在连续传代过程中，经检测，非 洲绿猴肾细胞系VeroBlO株没有细菌、真菌、支原体W及常见的几种交叉感染病毒等外源 污染，并且不存在致瘤风险，安全性高。
[0012] 本发明还提供了一种应用本发明所述的细胞株培养病毒的方法，其包括： 将非洲绿猴肾细胞系VeroBlO株接种于培养瓶，于37°C5%C02条件下4化可W长成 致密单层，接种病毒的病毒液0.5血，加入含2%胎牛血清的DMEM维持液，于37°C5%0)2 条件下培养；逐日观察细胞病变细胞病变达到80%W上时收获病毒，同样方法连续传=代， W确定病变稳定出现。
[0013] 根据本发明，所述可增殖的病毒包括山羊痘病毒、犬攝热病毒、黄病毒、小碟攝病 O
[0014] 本发明的有益效果是：该非洲绿猴肾细胞系VeroBlO在接种山羊痘病毒AV41株， 犬攝热病毒CDV-Iv化株，黄病毒FPV-Xinyu株，小碟攝病毒SYG26-35株后，细胞分别出现 了不同特征的病变，非洲绿猴肾细胞系VeroBlO株较之Vero母细胞更有利于四种病毒的 复制与增殖，因此，采用该细胞株进行病毒分离增殖培养有利于开展有关山羊痘病毒、犬攝 热病毒、黄病毒、小碟攝病毒的病原研究与疫苗防制，而且细胞株对于多种畜禽病毒敏感且 稳定，并能持续稳定增殖，该细胞株无支原体、细菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在致 瘤风险，安全性高具有广阔的开发和应用前景。
【附图说明】
[0015] 图1为实施例2中正常VeroBlO细胞株形态图； 图2为实施例2中VeroBlO细胞和母本Vero的生长曲线图； 图3为实施例3中接种山羊痘病毒AV41株后病变图片； 图4为实施例4中接种犬攝热病毒CDV-Iv化株株后病变图片； 图5为实施例5中接种黄病毒FPV-Xinyu株株后病变图片； 图6为实施例6中接种小碟攝病毒SYG26 - 35株后病变图片。
【具体实施方式】
[0016] 为了使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，运些实施例 仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通 常按照常规实验方法进行。
[0017]实施例一 Vero细胞系的克隆和筛选 1.Vero细胞有限稀释法克隆培养 将实验室保存的无支原体，细菌、真菌、外源病毒污染的Vero细胞经膜酶消化制成单 细胞悬液，细胞计数后进行连续梯度稀释，然后分别接种于96孔细胞培养板，37°C5%0)2 培养箱培养15d，挑选有单个细胞生长的细胞孔中的细胞转入24孔板培养，并依次将细胞 扩大培养，获得亚克隆细胞株。 阳〇1引 实施例二 非洲绿猴肾细胞系VeroBlO的生物学性状研究 1.细胞形态学 分别接长成单层的非洲绿猴肾细胞系VeroBlO株制备成细胞悬液，加入含8%胎牛血 清的DMEM生长液，于37°C5%C02条件下培养4她，观察细胞形态。细胞贴壁良好、形态饱 满、界限清晰，表面光滑。VeroBlO株较Vero母细胞细胞之间的界限更明显、整齐，细胞折光 性强，胞质饱满，核质清晰。
[0019] 2.细胞动力学检测 将长满单层的VeroBlO和母本Vero细胞制成细胞悬液，细胞计数后，细胞按5XIOVmL接种到24孔板，加入含有8%新生牛血清的DMEM培养基，于37°C5%C02条件下培养，每24h 取3个孔的细胞制成悬液，1:1的比例与台吩蓝混合后取10yL用细胞自动计数仪分别进行 计数，=次测定结果取平均值，连续测定屯天。根据表格绘制生长曲线。 恭1迦懸竣潑識力榮稳额爆
[0020] 由图2可W看出，非洲绿猴肾