骨性关节炎，有膝关节置换指征的患者病例。
[0033] 其中，临床诊断标准依据1995年美国风湿病协会所制定的标准：
[0034] (1) 1个月内大多数时间有膝痛；
[0035] (2)关节活动时响声；
[0036] (3)晨僵不大于30分钟；
[0037] (4)年龄不小于40岁；
[0038] (5)膝关节骨性肿胀伴弹响；
[0039] (6)膝关节骨性肿胀不伴有弹响。 W40] 最少存在（（1)、似、（3)、（4)或（1)、似、（3)、妨或（1)、（6)即可诊断0A。
[0041] 样品采集后，选择5例患者组2例对照组送往美吉生物公司进行转录组测序和全 基因组甲基化测序，并提供初步的分析结果。测序结果显示候选基因ASS1在骨性关节炎患 者膝关节软骨组织中低表达，同时该基因在患者膝关节软骨组织中甲基化程度明显高于正 常组。
[00创实施例2骨性关节炎患者及对照滑膜组织ASS1基因表达情况 阳0创 1.实验材料
[0044] 选取37例骨性关节炎患者滑膜组织及9例对照的滑膜组织，对其进行分组及编 号。病例组均符合膝关节0A诊断标准，进行膝关节置换手术患者；对照组为半月板损伤及 交叉初带损伤进行关节镜手术治疗的患者。 W45] 2.实验方法
[0046] 2. 1骨性关节炎患者及对照的滑膜组织总RNA的提取
[0047] 采用TR拉汾數Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操 作按产品说明书进行。
[0048]RNA质量判定标准：RNA样本的0D260/0D280值为1. 7-2. 2之间；总RNA电泳图谱 有清晰的28SU8S条带；70°C水浴保溫1小时后的电泳图谱与水浴保溫前的图谱无明显差 异。
[0049] 2. 2逆转录合成cDNA
[(K)加]采用S叩怯.IIIReverseTranscriptase(invitrogen，货号 18080-044)进 行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
[0051] 使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lyg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用 25y1反应体系，每个样品取1yg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20°C冰箱备 用。
[0052]2. 3 Real-Time PCR 阳〇5引引物设计
[0054] 采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_000050. 4(ASS1)，内参选GAPDH， 引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下： 阳化5] ASS1的Real-TimePCR扩增引物：
[0056]上游引物：GATTATGAGCCAACTGAT(沈QIDNO. 1);
[0057]下游引物：CTGGAGACGATGATATTC(沈QIDNO. 2);
[0058] 扩增长度为75bp。
[0059] 操作过程如下：
[0060]( 一）反应体系：用PowerSYBR:i;GreenPCRMasterMixQnvitrogen，货号 4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。
[0061]Rea^Time反应体系：2XmixlOyl;10uM浓度的上游引物和下游引物各0. 5^1， 模板2y1，加灭菌蒸馈水补平至25y1。
[0062] 扩增程序为：95°C5min预反应，进行38个循环（95°C15s，58°C30s)的扩增反应。 柳63](二）样品Real-TimePCR检测 W64] 将各样品cDNA10倍稀释后取2y1作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物 进行扩增。同时在60-95°C进行溶解曲线分析。 W65] 3.实验结果
[0066] 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增 效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物 溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公 式，比较ASS1基因在骨性关节炎组和对照组中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳 定，ASS1基因在骨性关节炎组中的滑膜组织表达水平仅为对照组织的约0. 3倍，W上结果 验证了高通量转录组表达数据的整合分析ASS1基因在骨性关节炎患者中低表达的结果。
[0067] 实施例3DNA的提取及甲基化修饰
[0068] 1.酪-氯仿抽提法处理DNA W例基因组DNA提取采用酪-氯仿抽提法，详细步骤如下：
[0070] (1)取0.Ig滑膜组织置于研磨中，加入液氮进行快速研磨，待研磨至粉末状时候， 将其转入是离屯、管中，并加600y1消化缓冲液，再加4y1蛋白酶K(1M)，摇匀后置于55°C水浴中至消化清透；
[00川 似用等体积的重蒸饱和酪，混匀，摇床慢速摇动20min，lOOOOg离屯、lOmin，取上 清液； 阳072] (3)加氯仿/异戊醇（24:1)酪：抽提液=1:1:2,混匀，摇床慢速摇动20min，离屯、 后取其上清液；
[0073] (4)加氯仿/异戊醇（24:1):抽提液==1: 1，混匀后再次离屯、取其上清液；
[0074] 妨加0.1倍体积醋酸钢（3M，抑=5.。和2倍体积冰冻的无水乙醇，混匀，冷冻 过夜； 阳0巧]化)4°C，12000g离屯、15min弃上清液；
[0076] (7)沉淀用500y1冰冻的70%乙醇充分洗涂，12000g离屯、5min，弃上清液； 阳077] 做重复执行步骤7,室溫下自然惊干； 阳07引 （9)用30-50y1双蒸水充分溶解沉淀，琼脂糖电泳检测DNA的完整性，-20°C冻存 备用。 阳0巧]2.DNA样品的修饰及纯化：
[0080]DNA甲基化的修饰是采用EZDNAMethylatiorTKit狂YM0RESEARCH,货号D5002) 进行，原理和经典的亚硫酸氨钢修饰基本相似。经试剂盒处理后，甲基化的胞喀晚未发生变 化，而未发生甲基化的胞喀晚（C)都将变成尿喀晚扣）。再设计分别针对甲基化和非甲基化 序列的特定引物，进行PCR的扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分析的方法来确定DNA的甲基化状 态变化。
[0081] 具体步骤： 阳0間（l)DNA的准备：将之前提取的DNA双蒸水稀释至25-100yg/ml后吸取20y1置 于PCR管中。
[0083] 似CT转化试剂（ConversionReagent)的制备：一个CT转化试剂管中添加 900y1水，300y1的M-稀释缓冲液和50y1的M-溶解缓冲液，室溫下溶解并震荡lOmin;
[0084] (3)将130y1CT转化试剂、20y1DM样品添加至PCR管中，若DM样本体积不 足20y1，可用去离子水补足差量，通过移液枪或者轻弹试管等操作混合样品；
[00财 （4)把样品放到循环变溫器中，先于98°C放置10分钟，再于64°C放置2. 5小时后， 马上进行一下步骤；
[0086] 巧）将600y1的M-结合缓冲液添加到Zymo-Spin1C?吸附柱中，并将吸附柱放 到收集管中；
[0087] (6)在含有M-缓冲液的Zymo-Spin1C?吸附柱中加入步骤（4)中的样品，封盖后 混匀样本； 阳〇8引（7)经30秒全速离屯、后去掉流出液；
[0089] 做将100 y 1 M-漂洗缓冲液添加到吸附柱中，并全速离屯、30秒；
[0090] (9)将200y1M-硫化缓冲液添加到吸附柱中，于室溫下放置20分钟，培养后全速 离屯、30秒； 阳0川（10)将200y1M-漂洗缓冲液添加到柱中，全速离屯、30秒后再添加200y1M-漂 洗缓冲液到柱内，再次全速离屯、30秒； 阳09引（11)直接将10y1M-洗脱缓冲液添加到柱中，将吸附柱放置在1. 5ml的EP管内， 全速离屯、洗脱DNA;
[0093](12)重复执行步骤11，EP管内即为所修饰和纯化的DNA;
[0094] (13)DNA储存在-70°C冰箱中备用。 阳0河实施例4 ASS1基因甲基化CpG位点的研究
[0096] 选择实施例3中的5个骨性关节炎组提取的DNA和5个对照组提取的DNA(均已 经进行了样品的修饰及纯化，即甲基化的胞喀晚未发生变化，而未发生甲基化的胞喀晚（C) 都将变成尿喀晚扣)）。W相应的BSP引物扩增SEQIDNO. 3 (序列长24化P)，所用引物见 表3,用凝胶电泳验证引物设计及是否成功，结果显示均得到目的扩增片段，其大小与预期 的大小一致。
CAGTGGGCATTTGCCAGGGAGCTG(沈Q ID NO. 3)
[0098] BSP引物：
[0099]上游引物：GTTTTTGTTGTTATTTTAGTTTTGA(SEQ ID NO.4); 阳100]下游引物：CAACTCCCTAACAAATACCCACTAC (沈Q ID NO. 5) 阳101] 扩增长度为24化p。
[0102] 将回收纯化的PCR产物分别与pUClS-T载体连接W构建BSP-PCR产物重组质粒， 然后进行连接产物转化制备感受态细胞，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落。用凝 胶电泳对目的片段克隆的菌落进行PCR鉴定W排除假阳性克隆，筛选正确的克隆进行后续 的测序分析。 阳103] 为提高对克隆甲基化测序结果的有效性，每个实验组选取5个鉴定正确的克隆进 行测序分析。在材料方法中已经阐述，待测序列位置一共有6个CpG位点。利用SeqMan软 件对无明显干扰信号的测序结果进行序列比对，得到每个克隆中待检测6个CpG位点的甲 基化状态。分析结果表明亚硫酸盐转化效率均达到98%或W上，符合亚硫酸盐转化实验要 求，表明BSP分析结果可靠。结果显示在第4个CpG的位点（16化P)发生了甲基化，对照组 未甲基化，说明该位点的甲基化可能是ASS1基因低表达及骨性关节炎致病相关的原因之 一。此外，在第5个CpG的位点（168bp)发生了部分甲基化。
[0104]实施例5甲基化特异性PCR (