一种固定化酶反应器及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种固定化酶反应器及其制备方法，以及其在蛋白质组学、酶催化反应中的应用。
【背景技术】
[0002]对于常用的基于bottom-up策略的蛋白组学研究方法，蛋白质的酶解是必不可少的样品前处理步骤。传统的自由溶液酶解方法具有酶解时间长、酶解效率低、酶易自降解等诸多缺点。为解决这些问题，近年来，人们把蛋白酶固定在不同的基质上，制备成固定化酶反应器(IMER, immobilized enzymatic reactor),可显著缩短酶解时间、提高酶解效率、蛋白酶可反复利用。
[0003]目前，已经有各种微球颗粒基质如有机填料(Slysz, et.al Analchem.2006，1959-1966)、硅胶颗粒、玻璃珠(Li，et.al Anol.B1anal.Chem.2006，614-620)等被应用于酶的固定化。然而上述基质材料尽管易于填装成柱，但其表面修饰复杂且比表面积小，因此制备的固定化酶反应器的酶活不高，且制备过程繁杂。纳米基质材料(Qiao, L.，et.al Chem.Eur.J.2008，14，151-157)，尽管比表面积大、酶固载容量高，但无法填装成柱，不利于在线酶解。
[0004]针对上述问题，我们设计了一种氧化石墨烯纳米薄片-聚合物微球杂化复合材料基质的固定化酶反应器。该酶反应器不仅具有酶固载容量高、稳定性好等优点，而且具有较高的酶解效率，在蛋白组学中具有很好的应用前景。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明目的在于提供一种氧化石墨烯纳米薄片-聚合物微球杂化复合材料基质的固定化酶反应器。该酶反应器不仅可以实现高通量的蛋白质酶解，而且还具有很好的稳定性，可多次重复使用。为了实现该目的，本发明的技术方案是:
[0006]1、氨基聚合物分散于有机溶剂中，氧化石墨烯分散于弱酸性缓冲溶液中形成氧化石墨烯溶液。在不锈钢柱管中通过一端真空抽吸的方式从另一端依次交替装入氨基聚合物微球和氧化石墨烯，使氧化石墨烯通过层层组装的方式吸附在氨基聚合物微球上，形成氧化石墨烯纳米薄片-聚合物微球杂化复合基质材料；
[0007]其中不锈钢管的内径为1.0mm-4.6mm ;氨基聚合物微球为氨基丙烯酸酯聚合物多孔微球，氨基聚合物微球的粒径范围为5-30 μ m,氨基聚合物微球的分散剂包括甲醇、乙醇或乙腈中的一种或两种以上，氨基聚合物微球浓度范围为0.5-5mg/mL ;氧化石墨烯分散剂为lOmM-lOOmM pH5.6的MES (2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲溶液，氧化石墨烯的浓度范围为
0.2-3mg/mL ;每次氨基聚合物微球的装入量为10 μ L-30 μ L ;每次氧化石墨烯的装入量为10 μ L-30 μ L。
[0008]2、在低温条件下连续通入蛋白酶溶液，通过蛋白酶与氧化石墨烯的静电相互作用实现蛋白酶的固载。具体步骤如下:
[0009]蛋白酶溶于缓冲溶液中，加入少量的酶抑制剂，于低温下通入酶反应器中，反应24h，使蛋白酶通过静电吸附作用固定在氧化石墨烯纳米薄片-聚合物微球杂化复合基质上；
[0010]其中，蛋白酶的种类包括:胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳蛋白酶、羧肽酶或糖苷酶，蛋白酶浓度范围为1-lOmg/mL。
[0011]3、按照以上方法制备的固定化酶反应器可应用于蛋白质组学领域或酶催化反应，实现蛋白质的酶解或反应催化过程。与毛细管电泳联用或液相色谱联用，可实现蛋白质在线的分离、酶解、多肽分离及质谱鉴定。
[0012]本发明具有如下优点:
[0013]1、制备所需时间短,制备通量大；
[0014]2、基质材料的制备过程简单、条件温和，容易控制，制备重复性好；
[0015]3、酶的固定条件温和，且固载容量大，酶活高；
[0016]4、通透性高、稳定性好，使用寿命长。
【附图说明】
[0017]图1为固定化酶反应器制备流程图；
[0018]图2(a)为固定化胰酶反应器酶解牛血清白蛋白的质谱分析图；
[0019]图2(b)为固定化胃蛋白酶反应器酶解牛血清白蛋白的质谱分析图。
【具体实施方式】
[0020]实施例1
[0021]1、基质材料的制备:称取lmg粒径为10 μ m的氨基丙烯酸酯聚合物微球，分散于lml无水乙醇中，称取10mg氧化石墨烯分散于30mL100mM pH5.6的MES(2_(N_吗啉代)乙磺酸)缓冲溶液中，在不锈钢柱管的一端装入孔径为2μπι的筛板，通过真空抽取(真空度为-0.08MPa)的方式，从不锈钢柱管的另一端按照聚合物-氧化石墨烯-聚合物-氧化石墨烯(每次装入体积为20 μ L)层层组装的方式依次把填料装入1.0mm内径的不锈钢管中，装满填料后，装入孔径为20 μ m的筛板。
[0022]2、酶的固定化:用50mM pH8.0的磷酸盐缓冲溶液平衡酶反应器30min，称取胰蛋白酶(trypsin) 3mg,苯甲脒(酶抑制剂)32mg,耳又50mM pH 8.0的磷酸缓冲盐lmL溶解后,通入填充柱中，4°C反应24h。再用含20% (v/v)乙腈的pH 8.0的磷酸缓冲盐冲洗4h，即制备得氧化石墨烯纳米薄片-聚合物微球杂化复合材料基质的胰蛋白酶固定化酶反应器。如图1所示。
[0023]实施例2
[0024]1、基质材料的制备:称取3mg粒径为10 μ m的氨基丙烯酸酯聚合物微球，分散于lmL无水乙醇中，称取10mg氧化石墨烯分散于lOmLlOOmM pH5.6的MES缓冲溶液中，在不锈钢柱管的一端装入孔径为2 μ m的筛板，通过真空抽取(真空度为-0.08MPa)的方式，从不锈钢柱管的另一端按照聚合物-氧化石墨烯-聚合物-氧化石墨烯(每次装入体积为20 μ L)层层组装的方式依次把填料装入1.0mm内径的不锈钢管中，装满填料后，装入孔径为20 μ m的筛板。
[0025]2、酶的固定化:用pH5.0的磷酸盐缓冲溶液平衡酶反应器30min，称取胃蛋白酶(pepsin) 5mg,取50mM pH5.0的磷酸缓冲盐lmL溶解后,通入填充柱中，4°C反应24h。再用含20% (v/v)乙腈的pH5.0的磷酸缓冲盐冲洗4h，即制备得氧化石墨烯纳米薄片-聚合物微球杂化复合材料基质的胃蛋白酶固定化酶反应器。
[0026]实施例3
[0027]酶反应器的评价:分别将0.2mg/mL BSA以1 μ L/min连续通入胰蛋白酶固定化酶反应器(实施例1)和胃蛋白酶固定化酶反应器(实施例2)中，收集组分，并通过MALD1-T0FMS检测，经数据库检索，胰蛋白酶固定化酶反应器的评价结果:BSA的序列覆盖率为52%(如图2(a))，胃蛋白酶固定化酶反应器评价结果如图2(b)所示。
【主权项】
1.一种固定化酶反应器，其特征在于: 在不锈钢柱管中通过一端真空抽吸的方式从另一端依次交替装入氨基聚合物微球和氧化石墨烯，使氧化石墨烯通过层层组装的方式吸附在氨基聚合物微球上，形成复合基质材料，然后连续通入蛋白酶溶液，使酶通过静电吸附固定在基质材料上，制备成固定化酶反应器。2.按照权利要求1所述的固定化酶反应器，其特征在于: 不锈钢柱管的内径为1.0mm-4.6mm ； 氨基聚合物微球在装入不锈钢柱管的过程中所采用的分散剂为甲醇、乙醇或乙腈中的一种或两种以上； 氧化石墨烯在装入不锈钢柱管的过程中所采用的分散剂为10mM-100mMpH5.6的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲溶液； 氨基聚合物微球的浓度范围为0.5-5mg/mL ;氧化石墨烯的浓度范围为0.2_3mg/mL。3.按照权利要求2所述的固定化酶反应器，其特征在于: 氨基聚合物微球是一种氨基丙烯酸酯聚合物多孔微球，氨基丙烯酸酯微球的粒径范围为 5-30 μ m。4.按照权利要求1所述的固定化酶反应器，其特征在于: 所述的蛋白酶种类包括:胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳蛋白酶、羧肽酶或糖苷酶，蛋白酶溶液的浓度范围为1-lOmg/mL。5.按照权利要求1所述的固定化酶反应器，其特征在于: 酶的固载是通过蛋白酶与氧化石墨烯的静电相互作用实现的；氧化石墨烯通过物理吸附作用固定在氨基聚合物微球上。6.按照权利要求1所述的固定化酶反应器，其特征在于: 每次氨基聚合物微球的装入量为10yL-30yL;每次氧化石墨烯的装入量为10 μ L-30 μ L。7.—种权利要求1所述的固定化酶反应器可应用于蛋白质组学领域或酶催化反应，实现蛋白质的酶解或反应催化过程。8.按照权利要求7所述的固定化酶反应器的应用，其特征在于，与毛细管电泳联用或液相色谱联用，可实现蛋白质在线的分离、酶解、多肽分离及质谱鉴定。
【专利摘要】本发明涉及一种固定化酶反应器及其制备方法和应用。在不锈钢柱管中通过真空抽吸的方式顺序装入氨基聚合物微球和氧化石墨烯，通过层层自组装的方式，制备成纳米复合基质材料，然后连续通入蛋白酶溶液，使酶固定在基质材料上，制备成固定化酶反应器。与传统固定化酶反应器相比，该酶反应器具有制备简单、酶的固载容量高和低背压等优点。
【IPC分类】C12M1/40
【公开号】CN105274000
【申请号】CN201410337430
【发明人】张丽华, 邵文亚, 袁辉明, 杨开广, 张玉奎
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年7月15日