及保护作用，促进PCR反应。
[0026] 另外，PCR溶液中Mg2+浓度在1. 5~2. 0mmol/L之间时，可以很好地控制PCR反应 的产率和特异性。
[0027] PCR反应引物的终浓度一般为0. 1~1μΜ左右，浓度太高会导致非特异性扩增，太 低则扩增产物太少。
[0028] 此外，PCR反应中还可以加入助溶剂二甲亚砜（DMS0)和硫酸铵以降低碱基错配水 平，提高富含GC模板的扩增效率。这可能与消除引物和模板的二级结构，降低DNA解链温 度使DNA变性完全有关。
[0029] 根据本发明的另一方面，提供了一种用于测定人PLIN1基因rs894160位点多态性 的试剂盒，其包含：
[0030] 用于PCR扩增人PLIN1基因rs894160位点附近序列的上游引物和下游引物，其中 上游引物具有错配碱基C以获得含CTCGAR片段或者CCTCGARG片段的扩增产物，其中R为 人PLIN1基因rs894160位点上的待定碱基A或G ;以及
[0031] 能够识别CTCGAG片段与CTCGAA片段之一的限制性内切酶，或者识别CCTCGAGG片 段与CCTCGAAG片段之一的限制性内切酶。
[0032] 上述试剂盒中还可以包括其它成分，例如PCR反应Mix(包括4种dNTP混合物、 Mg2+、Taq DNA polymerase、Taq Antibody、缓冲液，DMS0和硫酸铵）和用于实施测定的说明 书等。
[0033] 本领域技术人员可以理解，除非有明显抵触，本发明的第一方面和第二方面的相 关特征可以相互组合。
[0034] 本发明的测定手段不但快速可靠，而且测定成本大大降低。
【附图说明】
[0035]图1描述了根据本发明的方法获得的酶切产物电泳紫外照片。其中Marker是：标 准参考位置；泳道1 :GG基因型；泳道2 :AG基因型；泳道3 :AA基因型。
【具体实施方式】
[0036] 下面对本发明进行详细描述。本领域技术人员应当理解，以下详细描述仅用于说 明而非限定本发明。
[0037] (1)待测DNA的获取
[0038] 采集不同人群外周血，提取基因组DNA后进行下面的PLIN1基因rs894160位点多 态性的测定。
[0039] 对于待测DNA的选择，本发明并没有特别的限制。既可以是从人体的体液或者组 织获得离体样本，还可以是经过预先降解处理的基因组。为了方便实施，通常优选从血液提 取离体样本。其中所述的组织包括人体中含有全部或至少PLIN1基因的组织，而与是否表 达该PLIN1基因无关。从体液和/或组织中提取DNA的方法是本领域技术人员公知的，并 且可以参考常用的分子生物学手册，例如《分子克隆》第2版进行。
[0040] ⑵引物设计与合成
[0041] 查找NCBI网站的Gene数据库和SNP数据库，分别获得PLIN1基因全序列和rs894160多态位点信息。
[0042]rs894160多态位点R前后部分碱基序列（碱基序列以5' 一 3'表示，大小写意义 相同）如下（SEQIDNO:1):
[0043]
[0045] 根据基因序列进行上游引物和下游引物设计，其中，上游引物引入错配碱基。在最 终所得扩增产物上，上游引物的错配碱基C与R之间相隔两个碱基GA。
[0046] 在本发明中，上游引物具有错配碱基C，且长度为35~60bp。其中一个实施例中， 引物如下，上游引物：5'GTAATAAGGAGTCTCTGTTTGTGGGGCTCCCT￡GA3'（SEQIDN0:2),下 游引物：5'AAAAATTCAATGAACCAGAGTGTCC3'（SEQIDN0:3)，其中上游引物下划线碱基为 错配碱基。
[0047] (3)制备PCR扩增产物
[0048] 根据上游引物和下游引物特征及PCR相应试剂制定PCR扩增程序和条件，制备 PCR扩增产物。其中一个实施例中，取基因组DNA(50~80ng)、上下游引物（终浓度为 0· 1 ~1μΜ)、2XPCRMix7. 5μL(包括 4 种dNTP混合物、Mg2+、TaqDNApolymerase、Taq Antibody、缓冲液，DMSO和硫酸铵）和双蒸水共同组成15μL反应体系，调整溶液pH为7. 3 左右。PCR反应条件为：95°C预变性30s，95°C变性30s- 60°C退火30s- 72°C延伸20s共 30个循环，72°C延伸7min。PCR反应后获得稳定的扩增产物。
[0049] (4)酶切反应
[0050] 本发明可以采用BsoBI、Xhol、PaeR7I、Aval、Smll、PspXI内切酶，为PLIN1 基因 rs894160位点的多态鉴定提供了多种可选择的内切酶，实验时可以根据市场价格选择合适 的内切酶。目前部分内切酶价格比较低廉，如表1所示。
[0051] 表1NEB公司几种内切酶识别序列及其价格
[0052]
[0053] 注：Y为C或T，R为A或G，V为A或C或G，B为C或G或T，N为A或T或C或G
[0054] 其中一个实施例中，取PCR产物10yL，加入5U内切酶BsoBI、2yL10X酶切缓冲 液和7. 5μL双蒸水组成20μL反应体系，37°C水浴中酶切4~12h，即得酶切产物，酶切产 物经1倍浓缩后电泳观察。
[0055] (5)电泳测试
[0056] 其中一个实施例中，PCR产物经BsoBI酶切后如果不能切开则仍为118bp，如果被 切开则出现87bp和31bp(由于BsoBI酶切产生粘性末端使其互补链碱基数目不同，因此 切开后片段长度以基因序列上单链碱基数目为准来计算），其中31bp片段电泳图中难以分 辨。
[0057] 将酶切产物在2~4%琼脂糖凝胶中3~8V/cm条件下，电泳30~80min，于紫外 灯下拍照测定。酶切电泳图见图1，依据118bp和87bp片段的有无判断来判断基因型：AA 型为118bp-个片段，AG型有118bp、87bp片段，GG型为87bp-个片段。
[0058] 下面是实施本发明的若干实施例。
[0059] 实施例1提取人外周血白细胞DNA测定rs894160多态性
[0060] 1材料与方法
[0061] 1.1主要试剂及仪器
[0062]试剂：2XPCRMix(包括 4 种dNTP混合物、Mg2+、TaqDNApolymerase、Taq Antibody、缓冲液，DMSO和硫酸铵），限制性内切酶BsoBI(NEB公司），琼脂糖（Biowest公 司），引物由上海Sangon公司合成。
[0063]仪器：9600 型PCR仪（PE公司），微型电泳槽（Pharmacia Biotech, EPS1000)，Gel Doc2000凝胶成像仪（Bio-RAD公司）。
[0064] 1. 2从外周血白细胞中提取DNA作为待测基因组DNA模板
[0065] EDTA_K2抗凝管采集人外周血lmL，参考《实用流式细胞术彩色图谱》中白细胞的分 离方法进行白细胞分离，参考《分子克隆》中氯化钠盐析法提取白细胞基因组DNA，并作为待 测人基因组DNA模板。
[0066] 1. 3序列查找及引物设计
[0067] 在NCBI网站查找PLIN1基因序列和rs894160多态位点信息来设计引物，具体如 下：
[0068]上游引物：5，GTAATAAGGAGTCTCTGTTTGTGGGGCTCCCT￡GA3,（SEQIDN0:2);
[0069]下游引物：5'AAAAATTCAATGAACCAGAGTGTCC3'（SEQIDN0:3)
[0070] 1.4PCR扩增
[0071] 取基因组DNA(50~80ng)、上下游引物（终浓度为0· 1~1yM)、2XPCRMix 7.5以1^(包括4种(11^1：)混合物、]\%2+、1&9〇嫩。〇15〇116抑86、1&9 4111:;[130(17、缓冲液，0]\130和 硫酸铵），灭菌双蒸水补足15μ1反应体系，调整溶液pH为7. 3左右。
[0072]PCR反应条件为：95°C预变性30s，95°C变性30s- 60°C退火30s- 72°C延伸20s 共30个循环，72°C延伸7min。PCR反应后获得稳定的扩增产物。
[0073] 1. 5酶切鉴定
[0074]PCR扩增后，取PCR产物10μ1，加入5U内切酶BsoBI和2μ1 10X酶切缓冲液和 灭菌双蒸水组成20μ1反应体系，37 °C水浴中酶切4h后，即得酶切产物。
[0075] 上述酶切产物经1倍浓缩后，在3%琼脂糖凝胶5V/cm条件下，电泳40min，于紫外 灯下拍照鉴定多态类型。
[0076] 2 结果
[0077] 2. 1PCR扩增结果
[0078] 扩增后序列（其位于SEQIDN0:1碱基序列的466~583处，共118bp)，所获得 的扩增产物序列如下（SEQIDNO:4):
[0079]
[0080] 扩增后产物序列中下划线部分分别为上游、下游引物所对应的序列，R代表A/G多 态即SNP位点rs894160。
[0081] 2. 2酶切结果
[0082] 经内切酶BsoB