株高产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌D突变株，为今后丰加霉素产业化生产奠定基础。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例对本发明利用联合抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的方法做进一步描述。
[0014]实施例1:低浓度链霉素抗性突变株的获得(第一轮抗药性突变株筛选)
制备链霉素终浓度为100 μ g/mL的GYM固体平板，也即GYM固体平板中链霉素浓度为100 μ g/mL。用移液枪吸取1000 μ L淀粉酶产色链霉菌D孢子悬液(I X 16个/mL)于GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 °C培养箱培养7天，分别挑取单菌落至新的含有100 μ g/mL链霉素的GYM固体平板(一个单菌落划一个平板)，置28 °C培养箱培养5天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为低浓度链霉素抗性突变株。共获得低浓度链霉素抗性突变株8株，编号分别为fll，fl2，fl3，fl4，fl5，fl6，fl7和fl8，对这8株突变株按照技术方案中的步骤(4)进行液体发酵培养，发酵液经HPLC检测，发现其中突变株Π1产丰加霉素能力较高，为483.58 mg/L，发酵水平是对照菌株淀粉酶产色链霉菌 D (151.12 mg/L)的 3.2 倍；
实施例2:高浓度链霉素抗性突变株的获得(第二轮抗药性突变株筛选)
制备链霉素终浓度为2000 μ g/mL的GYM固体平板，也即GYM固体平板中链霉素浓度为2000 μ g/mL。用移液枪吸取1000 μ L低浓度链霉素抗性突变株fll孢子悬液(I X 112个/mL)于GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 °C培养箱培养10~15天，分别挑取单菌落至新的含有2000 μ g/mL链霉素的GYM固体平板(一个单菌落划一个平板)，置28°C培养箱培养7~10天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为高浓度链霉素抗性突变株。共获得高浓度链霉素抗性突变株3株，编号分别为s223，s225, s228，对这3株突变株按照技术方案中的步骤(4)进行液体发酵培养，发酵液经HPLC检测，发现其中突变株s228产丰加霉素能力较高，为925.63 mg/L,发酵水平是对照菌株淀粉酶产色链霉菌D(153.01 mg/L)的 6.05 倍；
实施例3:巴龙霉素抗性突变株的获得(第三轮抗药性突变株筛选)
制备巴龙霉素终浓度为50 μ g/mL的GYM固体平板，也即GYM固体平板中巴龙霉素浓度为50 μ g/mL。用移液枪吸取1000 μ L高浓度链霉素抗性突变株s228孢子悬液(I X 112个/mL)于GYM固体平板上，用无菌涂布棒涂布均匀，置28 °C培养箱培养10~15天，分别挑取单菌落至新的含有50 μ g/mL巴龙霉素的GYM固体平板(一个单菌落划一个平板)，置28°C培养箱培养7~10天，能再次在该新的GYM固体平板上长出的菌株即为巴龙霉素抗性突变株。共获得巴龙霉素抗性突变株2株，编号分别为t3141和t3145 ；
实施例4:突变株液体发酵
发酵培养:发酵培养液为每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g，黄豆粉40 g，NH4Cl 3g，CaCO3 5 g，MgSO4 2 g，余量为水；每300 mL三角瓶装60 mL发酵培养液，配制后121 °C灭菌20 min，待冷却至50 °C，无菌条件下分别挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D、突变株t3141和突变株t3145孢子接种，28 °C ± I °C，发酵培养6天；发酵液经5000 r/min离心10 min，上清液用于丰加霉素含量的测定；
实施例5:丰加霉素的检测方法:采用SHIMADZU C18色谱柱(150 mmX4.6 mm, 5 μπι)，甲醇为流动相Α，水为流动相 B，梯度洗脱，洗脱程序为 0-15 min，5%-37% A ； 15-30 min，37%_100% A ;30_40 min,100%-5% A;流速 1.0 mL/min，检测波长 279 nm，柱温 30 °C。
[0015]结果表明:淀粉酶产色链霉菌突变株t3145和t3141发酵液中丰加霉素的含量分别为 2294.95 mg/L 和 1985.15 mg/L，与对照 150.39 mg/L 相比分别提高了 15.26 和 13.20倍，其中淀粉酶产色链霉菌突变株t3145合成丰加霉素的能力最强，发酵效价达到2294.95mg/L ο
【主权项】
1.利用联合抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的方法，其特征在于通过联合抗药性突变株的筛选，获得对低浓度链霉素100 μ g/mL、高浓度链霉素2000 μ g/mL和巴龙霉素.50 μ g/mL都产生抗药性的淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) D的突变株，获得的突变株产丰加霉素的能力比淀粉酶产色链霉菌D显著提高，所述的淀粉酶产色链霉菌D已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2007年5月25日，保藏登记号CGMCC N0.2060。2.权利要求1所述的突变株合成丰加霉素的方法，其特征在于发酵培养液为每1000mL中含有可溶性淀粉20 g，黄豆粉40 g，NH4C1 3 g，CaC03 5 g，MgS04 2 g，余量为水，每.300 mL三角瓶装60 mL发酵培养液，配制后121°C灭菌20 min，待冷却至50 °C，无菌条件下分别挑取一铂金环淀粉酶产色链霉菌D和抗药性突变株孢子接种，28°C 土 1°C，发酵培养.6天，发酵液经5000r/min离心lOmin，上清液用于丰加霉素含量的测定。
【专利摘要】本发明公开了利用联合抗药性突变株筛选提高丰加霉素产量的方法，属于微生物技术领域。该方法通过联合抗药性突变株的筛选，获得对低浓度链霉素、高浓度链霉素和巴龙霉素都产生抗药性的淀粉酶产色链霉菌（<i>Streptomyces？diastatochromogenes</i>）D的突变株，获得的突变株产丰加霉素的能力比淀粉酶产色链霉菌D显著提高。CGMCC No. 206020070525
【IPC分类】C12P19/40, C12N1/20, C12R1/525
【公开号】CN105349476
【申请号】CN201510966008
【发明人】申屠旭萍, 许益鹏, 俞晓平, 汤谷, 刘楠楠
【申请人】中国计量学院
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月22日