1.口.136~137。〇；1!1匪1?(〇)(：1 3,4001抱）3:1.10(8,9!1，3\〇13)，4.59(8， 2H,NCH2) ,5. 93 (s,ΙΗ,ΝΗ) ,6. 99(dd,J= 8. 4,7. 5Hz, 1HC6H35-H), 7. 72(dd,J= 7. 5,1. 5Hz, 1HC6H36-H) ,8. 05(s, 1H,C2N3H23-H), 8. 08 (dd,J= 1. 5,8. 4Hz, 1H,C6H34-H), 8. 19 (s, 1H, C2N3H25-H)，11. 03(s，1H，OH)。
[0091] 实施例17
[0092] 4-叔丁基-5-(1，2,4-三唑-1-基）-2-(2-羟基-5-硝基苄氨基）噻唑的制备
[0093]
[0094] 0. 74g(2mmol) 4-叔丁基-5- (1，2，4-三唑-1-基）-2- (2-羟基-5-硝基苄亚氨 基）噻唑、20mL乙醇，0. 07g(2mmol)硼氢化钠，反应15min，盐酸调节pH= 6-7,倒入100mL 水中，固体析出，抽滤，干燥得到浅黄色固体4-叔丁基-5-(1，2,4-三唑-1-基）-2-(2-羟 基-5-硝基苄氨基）噻唑 0· 63g，收率 84%，m.ρ· 194 ~196°CNMR(CDC13,400MHz)δ: 1. 20 (s,9H,3XCH3) ,4. 63(d,J= 5. 6Hz, 2H,NCH2), 5. 76(brs, 1H,NH), 7. 02(d,J= 5. 6Hz, 1H,C6H33-H) ,8. 08 (s, 1H,C2N3H23-H), 8. 14 (dd,J= 2. 8,5. 6Hz, 1H,C6H34-H) ,8. 16 (d,J= 2. 8Hz, 1H,C6H36-H)，8. 23(s, 1H,C2N3H25-H)，11. 59(brs, 1H,OH)。
[0095] 实施例18
[0096] 4-叔丁基-5- (1，2,4-三唑-1-基）-2- (2-羟基-3, 5-二硝基苄氨基）噻唑的制 备
[0097]
[0098] 0· 84g(2mmol) 4-叔丁基-5- (1，2，4-三唑-1-基）-2- (2-羟基-3，5-二硝基苄亚氨 基）噻唑、20mL乙醇，0. 07g(2mmol)硼氢化钠，反应15min，盐酸调节pH= 6-7,倒入100mL 水中，固体析出，抽滤，干燥得到浅黄色固体4-叔丁基-5-(1，2,4-三唑-1-基）-2-(2-羟 基-3,5-二硝基苄氨基）噻唑0.75 8，收率90%，111.口.118~1201：;1!1匪1?(〇)(：1 3,4001抱） δ:1.02(s，9H，3XCH3)，4.27(d，J= 7.0Hz，2H，NCH2)，6.57(s，1H，NH)，8.02(s，J= 3. 1Hz，1H，C6H24-H)，8· 16(s，1H，C2N3H23-H)，8· 58(d，J= 3. 1Hz，1H，C6H26-H)，8· 85(s，1H， C2N3H25-H) 〇
[0099] 实施例19
[0100] 5-(l，2,4-三唑-1-基）-2-苄氨基噻唑衍生物的抗肿瘤活性
[0101] 1.抗肿瘤活性原理
[0102] MTT法生物活性测试又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂噻唑蓝[3-(4, 5-二甲基-2-噻唑）-2, 5-二苯基溴化四氮 唑；3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl_tetrazoliumbromide，MTT]为基础。 MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀 酸脱氢酶和细胞色素C的作用下四氮唑环（tetrazolium)开裂，生成蓝色水不溶性的甲瓒 (Formazan)结晶并沉积在细胞中，甲瓒结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥 珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。二甲基亚砜（DMS0)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免 疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内， MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
[0103] 2.抗肿瘤活性实验
[0104] 试样：5-(1，2,4_三唑-1-基）-2-苄亚氨基噻唑衍生物和5-(1，2,4_三 唑-1-基）-2-苄氨基噻唑衍生物（I):
[0105]
[0106]式中R选自A~C2烷基、C3~C4直链或支链烷基；X1选自：氢、氘、甲基、乙基、C3~c4直链烷基或支链烷基；X2、X4选自：氢、氘、甲基、乙基、氟、氯、溴、硝基；X3选自：氢、 氣、甲基、乙基、C3~C4直链烷基或支链烷基；X5选自：羟基、甲氧基、乙氧基。
[0107] 细胞系：宫颈癌细胞系Hela(中南大学湘雅医学院细胞库提供）。
[0108] 试剂：噻唑蓝（MTT)、RPMI1640培养液、新生牛血清、抗生素（美国英杰生命技术 公司）；胰酶（美国AMRESC0公司）；96孔培养板（美国英杰生命技术公司）；二甲基亚砜 (美国Sigma公司）。
[0109] 仪器：HFsafe-1500型超净工作台、HF151UV型C02培养箱（上海力申科学仪器有 限公司）；XSP-15C型倒置显微镜（上海长方光学仪器有限公司）；MultiskanMK3型酶标仪 (美国Thermo公司）；超纯水制备仪（美国Milli-Q公司）。
[0110] 实验操作：试样对于hela细胞的测试。细胞的实验操作过程相同，一次实验过程 中，每种试样设置5个浓度梯度，每个浓度四个平行试样，并通过空白组对照得出结论。
[0111] 1)倒掉长满癌细胞的培养瓶中的培养基，加入5mLPBS清洗，倒掉PBS，加入lmL 胰酶，放入37°C、5 %C02培养箱。
[0112] 2)取出培养瓶，加入RPMI1640培养基，用吸管反复吸打吹散细胞。
[0113] 3)细胞悬液接种于96孔培养板，第1孔不加细胞悬液，其余每板100μL(约10000 个细胞），放入37°C、5% 0)2培养箱中培养中48小时。
[0114] 4)试样配置。用DMS0作为溶剂，配置浓度梯度为1. 0μmol/mL、0. 3μmol/mL、 0. 1μmol/mL、0. 03μmol/mL、0. 01μmol/ml,的溶液。
[0115] 5)吸取每孔内的悬浮液，加入试样，放入37°C、5%C02培养箱中培养中48小时。 每组实验平行3次。
[0116] 6)取出上药48小时的96孔培养板，吸出每孔培养液，每孔120μLPBS清洗一次， 加入每孔20μL5mg/mLMTT液，放入37°C、5%C02培养箱中培养中3~4小时。
[0117] 7)吸出孔内MTT后，加入每孔150μLDMS0液（包括第1空），将培养板置于微孔 板板荡器上振荡，使结晶物溶解。
[0118] 8)酶标仪检测各孔0D值（检测波长570nm)。
[0119] 3.抗肿瘤活性评价
[0120] 1)细胞抑制率计算：
[0121] 细胞抑制率（％ )=(正常0D值一加药0D值）/正常0D值X100%
[0122] 2)IC5。值计算
[0123] 试样浓度对数值与细胞抑制率线性回归，计算试样对细胞的半数抑制浓度IC5。 值。试样对于hela细胞的IC5。见表1。
[0124] 表15-(1，2,4-三唑-1-基）-2-苄氨基噻唑衍生物（0.100臟〇1/1)和5-(1，2， 4-三唑-1-基）-2-苄亚氨基噻唑衍生物（0. 100mmol/L)对于hela细胞的抑制率和IC5。
[0125]
[0126] 测试结果显示，4-叔丁基-5-(1，2,4-三唑-1-基）-2-苄氨基噻唑对于人宫颈癌 细胞（hela细胞）具有良好的抑制活性，可用于制备抗肿瘤药物。4-叔丁基-5-(1，2, 4-三 唑-1-基）-2- (2-羟基-5-硝基-3-碘苄亚氨基）噻唑对于人宫颈癌细胞（hela细胞）具 有良好的抑制活性，可用于制备抗肿瘤药物。
【主权项】
1. 化学结构式I所示的5-(1，2,4-三唑-1-基）-2-苄氨基噻唑衍生物或其盐：其中R选自A~C2烷基、C3~C4直链或支链烷基；X1选自：氢、氘、甲基、乙基、C 3~ (：4直链烷基或支链烷基；X2、X4选自：氢、氘、甲基、乙基、氟、氯、溴、硝基；X 3选自：氢、氘、甲 基、乙基、C3~C4直链烷基或支链烷基；X 5选自：羟基、甲氧基、乙氧基；盐选自：盐酸盐、氧 溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。2. 权利要求1所述的5-(1，2,4-三唑-1-基）-2-苄氨基噻唑衍生物优选式II所示的 4_叔丁基-5- (1，2,4-三唑-1-基）-2-苄氨基噻唑衍生物：其中X1选自：氢、氘、甲基、乙基、(：3~(：4直链烷基或支链烷基；X 2、X4选自：氢、氘、甲基、 乙基、氟、氯、溴、硝基；X3选自：氢、氣、甲基、乙基、(：3~(：4直链烷基或支链烷基；X 5选自：轻 基、甲氧基、乙氧基。3. 权利要求1所述的5-(1，2,4-三唑-1-基）-2-苄氨基噻唑衍生物优选式III所示的 4_叔丁基-5-(1，2,4-三唑-1-基）-2-(2-羟基苄氨基）噻唑：其中X1选自：氧、氣、甲基、乙基、C3~C4直链烷基或支链烷基、羟基、甲氧基、乙氧基； x2、x4选自：氢、氘、甲基、乙基、c3~c4直链烷基或支链烷基、氟、氯、溴、硝基；X 3选自：氢、 氘、甲基、乙基、c3~c4直链烷基或支链烷基。4. 权利要求1所述的5-(1，2,4_三唑-1-基）-2-苄氨基噻唑衍生物的制备方法；其 特征在于它的制备反应如下：式中R，X1~X5的定义如权利要求1所述。5. 权利要求1~3中任一项所述的5-(1，2,4-三唑-1-基）-2-苄氨基噻唑衍生物优 选下列化合物：6. 权利要求1~3和5中任一项所述的5-(1，2,4-三唑-1-基）-2-苄氨基噻唑衍生 物或其盐在制备抗人宫颈癌细胞药物中的应用。 7. 4-叔丁基-5- (1，2,4-三唑-1-基）-2- (2-羟基-5-硝基-3-碘苄亚氨基）噻唑：8. 权利要求1所述的4-叔丁基-5- (1，2,4-三唑-1-基）-2- (2-羟基-5-硝基-3-碘 苄亚氨基）噻唑或其盐在制备抗人宫颈癌细胞药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及化学结构式Ⅰ所示的5-(1,2,4-三唑-1-基)-2-苄氨基噻唑衍生物或其盐：，其中R选自：C1～C2烷基、C3～C4直链或支链烷基；X1选自：氢、氘、甲基、乙基、C3～C4直链烷基或支链烷基；X2、X4选自：氢、氘、甲基、乙基、氟、氯、溴、硝基；X3选自：氢、氘、甲基、乙基、C3～C4直链烷基或支链烷基；X5选自：羟基、甲氧基、乙氧基；5-(1,2,4-三唑-1-基)-2-苄氨基噻唑衍生物或其盐在制备抗人宫颈癌细胞药物中的应用。
【IPC分类】A61P35/00, C07D417/04
【公开号】CN105440029
【申请号】CN201410442572
【发明人】叶姣, 谢选青, 胡艾希, 丁娜
【申请人】湖南大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年9月2日