胰岛素样肽的制作方法
【专利说明】胰岛素样肽
[0001 ] 本发明专利申请是国际申请号为PCT/GR2010/000045，国际申请日为2010年10月8日，进入中国国家阶段的申请号为“201080053472.3”，发明名称为“胰岛素样肽”的发明专利申请的分案申请。
[0002]胰岛素样肽(INSL)，例如结构类似于胰岛素的这些肽，由2条肽链:A链和B链组成，此2条链通过2个分子间二硫键连接在一起，同时A链含有一个额外的分子内二硫键。一个例外是胰岛素样生长因子IGF-1和IGF-2，它们各由含70个氨基酸的一条肽链组成。
[0003]INSL家族除胰岛素外还包括INSL3、INSL4、INSL5、INSL6、松弛素I(RLNl)、松弛素2(RLN2)和松弛素3 (RLN3)以及生长因子IGF-1和IGF-2。
[0004]INSL肽显示具有重要的生物学性能，它们决定了代谢，例如胰岛素和IGF-1，并能调节生物体的重要状态，例如妊娠受RLNl、RNL-2和INSL4调节。
[0005]胰岛素销售用于治疗糖尿病并可视为最佳的被研究蛋白质，IGF-1用于重度原发性IGF-1缺陷病例治疗并在多项临床试验中针对适应征例如I型糖尿病、II型糖尿病、阿尔茨海默症、严重烧伤和肌强直性肌营养不良症(MMD)等，RLN2在临床试验中测试了对急性心力衰减、先兆子痫和硬皮病的效果，除此以外关于其他INSL及它们的衍生物和拮抗物的生物学性能和可能的治疗应用知之甚少。
[0006]一种情况中表明由一种INSL的A链和另一种INSL的B链组成的嵌合肽能与相应INSL的独特受体相互作用并显示显著的生物学活性。此外，已表明由IGF-1的A部分和IGF-2的B部分组成肽链的IGF具有额外的重要生物学活性。对于大量的其它嵌合肽证明同样如此。
[0007]尚未深入研究嵌合性INSL的生物学性能和可能的药学应用，因为它们的制备非常困难。事实上只制备和研究了由INSL5的B链和其它INSL的各种A链组成的嵌合肽。特别是，已发现由1?1^3的4链和1呢1^5的8链组成的1?1^34八呢1^5与6?0?135和6?0?142受体相互作用。
[0008]对于由INSL的二条不同链组成的嵌合肽仅有限研究的原因是其合成的难度和低产率。
[0009]迄今已采用的方法是A)随机混合直链A链与B链及其氧化，B)混合在半胱氨酸残基的巯基处含磺酸基团的A链，和C)定点构建A链与B链之间的三个二硫键。认为此方法是迄今为止制备INSL的最为改进的化学方法，虽然它需要多个步骤和5步层析纯化。显然所有上述方法非但不尽人意而且导致制备少量INSL的难度大及成本高。此外，这些方法不适合大规模生产。
[0010]由于化学合成困难，故采用重组DNA技术生产这些肽，例如胰岛素、松弛素和IGF。但是重组DNA技术比常规的肽和蛋白质合成方法更为复杂。因此，即使在最简单的IGF-1的情况中，还需要在分离得到其直链后选择性形成3个二硫键。
[0011]产生由2条肽链组成的INSL变得甚至更为困难，因为该情况中用重组DNA技术合它们的前肽，如前胰岛素、前松弛素等前肽后，需要选择性形成二硫键并最后用酶去除各前肽中间的C-肽段。
[0012]制备RLN2甚至更为复杂，在切除C肽段后需要额外的步骤通过加热将位于A链氨基末端的谷氨酰胺残基转变为焦谷氨酸残基。因此，即使生物技术制备的INSL也很难制成，且需要多步层析纯化才能获得药学上可接受纯度的INSL。这些巨大的困难和高生产成本导致极大地延误了对许多INSL生物学性能的评价和在临床试验中对它们的药学应用测试，虽然认为它们的生物学活性是肯定的。这对于含胰岛素链与其他INSL链结合的嵌合性INSL同样成立。
【发明内容】
[0013]近年来我们发现并报道了一种随机重组RLN1和RLN2链的简单制备方法。该方法显示很容易合成嵌合肽，例如由RNL2A/RLN1B所组成。用单环A链和双环A链时该合成方法特别有效。这表明A链含有结构信息使其能与不对应链的天然对的胰岛素B肽链结合。
[0014]在本发明中，我们描述了胰岛素样肽A链的结构特征使它识别并选择性结合胰岛素的所有B链和其它与那些肽相类似的链。肽链的结合总是选择性给出对应预期和天然胰岛素样的结合。
[0015]例如，本发明表明双环RLN2A识别并通过随机组合不仅连接其它INSL的B链，还与理论上对应于INSL的B链和对应于作为单链肽而天然所见的IGF-1和IGF-2的B链随机结合。这同样可用于其它胰岛素样肽的结合，使我们有可能容易地制备具有可能的药学活性的嵌合多肽。
[0016]在本发明中，描述了单环A链和双环A链反应的主要副产物是B链氧化成环形B链。具体说，INSL的直链B链与双环A链的反应非常快，如果A链过量在数分钟内即可将该B链氧化成环形B链同步形成胰岛素样肽。
[0017]双环A链肽有效氧化和产生二硫键连接的这种性能是一种氧化酶性能，因此我们可将胰岛素样肽的双环A链称为已知的最小的同时为强效的氧化酶，其还显示能容易地组合其它肽链的能力。
[0018]正是这种性能使得INSL的双环A链和类似的肽链作为用于蛋白质构象疾病的感兴趣治疗剂。因此，提供合适的双环INSL A链或类似肽，可能有助于改善因生物体功能障碍导致的蛋白质折叠缓慢。
[0019]我们还揭示INSL的双环A链易与只含不参与二硫键的半胱氨酸残基(例如导致糖尿病的某些胰岛素突变体中)的肽链反应。
[0020]为此，给予双环A链作为药物可对于通过它与突变蛋白的结合反应，然后通过生物体的ERAD系统或其它防御系统，破坏双环A链与突变蛋白的这种结合，来清除人体或动物体中的突变蛋白极其有益。
[0021]双环A链作为药物的递送将极为有益，因为它会与沉淀蛋白反应并溶解它们，还能与蛋白寡聚物或多聚物反应而溶解它们，并通过其氧化活性使之折叠而恢复它们的功能。
[0022]在本发明的另一种实施方式中，我们描述了一种INSL肽链的方便而有效的合成方法，通过采用2-氯三苯甲基和4-甲基二苯甲基化树脂的固相合成技术。此外，可采用本领域已知用于制备直链肽或肽酰胺的所有技术。
[0023]本发明描述了已知的INSL和嵌合肽的改进的化学合成方法。还首次描述了由2条链组成且链以胰岛素与其它胰岛素样肽2条链的链连接方式连接的IGF-1和IGF-2的嵌合性衍生物(图1)，及。还首次描述了由一种INSL的A链与另一种INSL的B链组成的一系列嵌合性INSLo
[0024]正确形成二硫键对INSL的肽合成非常重要。在本发明中，我们描述了形成正确-S-S_结合的方法。半胱氨酸残基的这些氧化反应可在各个链纯化之前或之后进行。也可用带保护形式的肽形成二硫化物/键连接。
[0025]如果2条链的合成采用固相法，二硫键的形成可以在树脂上、从树脂上切割肽后或从树脂上切割肽的同时进行。氧化半胱氨酸巯基以形成分子内二硫键可采用任何氧化剂进行，但优选用二甲基亚砜(DMS0)(JP Tam等，J Am Chem Soc，1991，113:6657-6662)氧化去保护INSL链;带保护的肽或部分去保护的肽则用碘氧化。
[0026]链装配时为了保护半胱氨酸的侧链巯基，可利用科学领域已知的保护巯基功能团的各种保护基团，但优选利用4-甲氧基三苯甲基(11111:)(1^11'108等，1111:.]\?6口1:丨(16 ProteinRes.1996,47,148-153)、三苯甲基(Trt)和乙酰胺基甲基(Acm)基团。
[0027]在本发明中，我们也描述了通过将胰岛素样肽的A链和B链氧化成相应的双环和单环A链和B链而提高其溶解度。因此在制备型高效液相层析(HPLC)中它们的洗脱大大早于相应的(还原)肽，因而对于纯化它们的应用简单而优于直链(还原)肽的应用。
[0028]为了在A链中选择性形成分子间二硫键，可利用任何一对正交保护基团，但优选采用 Trt/Mmt、Trt/Acm 和 Mmt/Acm 三对中的一对。
[0029]当采用Trt/Mmt对时，选择性去除S_Mmt基团后用合适的氧化剂，优选用空气或DMS0使已释放的游离巯基之间形成二硫键。优选用碘氧化去除S-Trt和Acm基团形成第2个二硫键。采用2-氯三苯甲基树脂(K.Barlos 等，Int.J.Pept.Protein Res.1991,37 ,513-520)或对酸具有相似敏感性的树脂固相合成A链时，用酸温和切割选择性去除S-Mmt基团与从树脂上切割该肽同时进行。
[0030]对于氧化去除S-Trt基团然后形成二硫键，可采用该领域已知的任何氧化剂但优选米用鹏。
[0031 ] 如果利用Tr t/Acm对，可利用合适的酸溶液，优选用含10_ 100 %浓度三氟乙酸的二氯甲烷液对该肽树脂进行酸处理，并以不同比例加入清除剂优选硫醇，甲硅烷和水，在S-Acm基团存在下选择性去除S-Trt基团。第1个二硫键的形成可采用该领域已知的任何氧化剂实现，但优选DMS0和空气。
[0032]可用碘氧