一种对神经细胞蛋白表达具有调节作用的多肽及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学或生物制药技术领域，特别涉及一种对神经细胞蛋白表达具 有调节作用的多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 智力发育迟缓(Mental Retardation, MR 或 Intellect Disability, ID)是儿童期 常见的精神疾病，严重威胁人口素质，给社会医疗卫生和经济造成很大的负担。目前从遗传 分析中已经发现了多个致病基因，对于这些分子表达调控和细胞功能的研究帮助我们更好 的了解大脑和神经发育的机制，也为我们寻找治疗疾病的方法提供了契机。脆性X综合症 (Fragile X syndrome,FXS)又称Martin-Bell综合症，是遗传性智力迟缓的首要病因，这类 病人通常还患有孤独症。1992年发现该病主要是由于脆性X智力发育迟缓蛋白FMR1 (Fragile X mental retardation 1)基因突变导致，FMR1 基因5'-端非翻译区（5'_UTR)的 (CGC)n三核苷酸重复序列发生反常的扩增，导致这部分被过度甲基化修饰，从而关闭基因 表达，使得FMRP蛋白量下降。作为一个RNA结合蛋，FMRP通过与下游特定RNA的结合，控制这 些基因表达的时间和地点。FMRP能和多聚核糖结合，起到翻译抑制子或增强子的作用，FMRP 可以通过与非编码RNA的相互作用调苄基因表达。FMRP能和微管网络结合，影响细胞内的物 质运输，FMRP是细胞内神经颗粒(neuronal granule)的组分，介导了mRNA和分子马达的结 合，参与mRNA的转运。FMRP参与了代谢性谷氨酸受体mGluR激活的信号通路。因此FMRP蛋白 的表达量高低对于神经细胞的正常功能至关重要，为了对瞬息万变的外界刺激做出及时而 准确的反应，神经细胞内也有一套严格的调控系统对FMRP进行精细的调控，从而控制它下 游靶向基因的表达和运输。由此可以推断，如果能寻找到调控FMRP表达的方式就可以干预 神经细胞的功能，这在神经细胞功能研究和很多神经系统疾病的药物治疗中都有广泛的用 途。
【发明内容】
[0003] 为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种对神经细胞蛋白表达具有调节 作用的多肽及其制备方法和应用，该多肽能够调控FMRP表达的方式，以干预神经细胞的功 能。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] -种对神经细胞蛋白表达具有调节作用的多肽，其具有SEQ IN NO: 1中第155到 194位氨基酸所示序列，命名为M3。
[0006] 本发明还提供了一种编码上述的M3多肽的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2 中第463到582位所示。
[0007] 本发明还提供了 一种具有上述DNA分子的载体。
[0008] 进一步的，所述载体为pFLAG-CMV2，它含有SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。
[0009] 进一步的，所述载体为pGEX-4T3，它含有SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。
[0010] 进一步的，所述载体为pEGFP-Cl，它含有SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。
[0011] 进一步的，所述载体为pUAST-attB，它含有SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。
[0012] 本发明同时提供了上述的对神经细胞蛋白表达具有调节作用的多肽的制备方法， 包括以下步骤：
[0013] 步骤一:获得可以编码SEQ IN NO: 1所示的氨基酸序列的DNA分子；
[0014]步骤二:将步骤一所获得的DNA分子与表达载体融合，构建重组表达 [0015]载体，并转化宿主细胞；
[0016]步骤三:诱导重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。 [0017] 进一步的，所述步骤一中，以编码正常人源PQBPl的cDNA为模版，以SEQIDN0:5所 示核苷酸序列为上游引物和SEQ ID N0:6所示核苷酸序列为下游引物扩增。
[0018] 本发明还提供了上述多肽在神经系统疾病的药物中的应用。
[0019] 进一步的，所述的药物为FMRP蛋白表达调控的药物，或者调节神经突触结构与功 能的药物。
[0020] 进一步的，所述的药物为调控神经细胞功能的生化试剂。
[0021] 本发明的有益效果是:本发明提供了一种多肽M3,含有M3多肽的融合蛋白可以特 异性与FMRP蛋白结合，在细胞内过表达含有M3多肽的融合蛋白可以明显降低FMRP蛋白的表 达，从而明显解除FMRP对下游基因翻译的抑制作用，增强下游基因的翻译表达。本发明同时 利用果蝇模型，展示该多肽在神经突触发育中的作用，在果蝇幼虫神经肌肉接头过表达含 有M3多肽的融合蛋白，显著影响bouton的形态结构。本发明可应用于多种神经系统疾病的 研究试剂和治疗药物的开发。
【附图说明】
[0022] 图1为重组活性多肽M3及其GST融合表达蛋白的电泳检测图；
[0023]图2为重组活性多肽M3及其GST融合蛋白的Western Blot检测；
[0024]图3为Western Blot检测活性多肽M3及其FLAG融合蛋白转染神经细胞后在神经细 胞中的表达；
[0025]图4为Western Blot检测活性多肽M3在转基因果蝇中的表达；
[0026]图5为活性多肽和FMRP蛋白的直接相互作用；
[0027] 图6a_d为在神经细胞中过表达活性多肽M3可以下调FMRP蛋白表达;其中，a为神经 细胞SH-SY5Y细胞转染Flag-WT，NC，和M3后用免疫荧光方法检测FMPR蛋白的表达量;b为a图 的统计结果;c为神经细胞SH-SY5Y细胞转染Flag-WT，NC，和M3后用免疫印记方法检测FMPR 蛋白的表达量;d为c图的统计结果；
[0028] 图7为体外泛素化实验中活性多肽融合蛋白可以增加 FMRP蛋白的泛素化修饰；
[0029] 图8为在神经细胞中过表达活性多肽M3可以增加 FMRP蛋白的泛素化修饰；
[0030] 图9a-b为在神经细胞中过表达活性多肽M3可以增加FMRP下游基因的表达;a为神 经细胞SH-SY5Y细胞转染EGFP-WT，NC，和M3后用免疫印记方法检测MAP1B蛋白的表达量;b为 神经细胞SH-SY5Y细胞转染Flag-WT，NC，和M3后用免疫荧光方法检测MAP1B蛋白的表达量； [00 31 ]图I0a-C为在果绳神经突触接头过表达活性多肽M3重组蛋白增加卫星bouton的数 目；其中，a图为用针对突触前标记HRP的抗体进行免疫荧光染色，展现bouton的结构，下面 一排为放大图；b为针对a中各个基因型中卫星bouton比例的统计结果;c为针对a各个基因 型中bouton总数的统计结果。
【具体实施方式】
[0032]本发明的多肽M3是由序列表中SEQ ID NO: 1自N末端第155-194位的氨基酸组成的 蛋白质，其DNA编码序列为SEQ ID N0:2中自5'末端463-582位核酸序列。
[0033] SEQ ID N0:1
[0034]
[0035] SEQ ID NO :2
[0036]
[0037]
[0038] 将SEQ ID N0:2所示序列接入细菌表达载体，并在细菌中表达该序列，可以翻译出 包含SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽，由此获得所需的多肽序列。
[0039] 将SEQ ID N0:2所示序列接入哺乳动物表达载体pFLAG-CMV2和pEGFP-Cl，转染哺 乳动物细胞，可以翻译表达出包含SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的多肽。
[0040] 将SEQ ID如:2所示序列接入果蝇细胞表达载体?1^31'-&?8，通过显微注射定点 插入果蝇基因组，利用UAS-GAL4系统，可在果蝇特定的组织中翻译表达出包含SEQ ID N0:1 所示氨基酸序列的多肽。
[0041] 本发明的多肽可以用于调节FMRP蛋白表达，通过细胞转染的方法将含有编码M3的 载体导入哺乳动物神经细胞中，可以下调FMRP蛋白表达。过表达M3多肽显著增加 FMRP蛋白 的泛素化水平，促进蛋白质降解。在体外用重组蛋白构建的反应体系中，含有M3多肽的反应 组内，FMRP的泛素化水平明显升高。
[0042]下面结合具体实施例及附图对本发明作更进一步的说明。
[0043]实施例1:M3多肽及其编码基因的获得。
[0044] 1.1首先用Trizol试剂提取人源SH-SY5Y神经瘤细胞的总mRNA，反转录试剂盒 (InVitrogen)将mRNA反转录为cDNA，分别以SEQINN0:3所示的核苷酸序列为上游引物，以 SEQ IN N0:4所示的核苷酸序列为下游引物，通过PCR获得了编码正常人源PQBPl(Gene ID: 10084)(简称WT)序列，通过BamHI和Notl双酶切将cDNA克隆到pFLAG-CMV2表达载体中，并转 化大肠杆菌DH5a，随机挑选cDNA克隆进行测序并获得正确构建的载体。
[0045] 5;-ATAAGAATGGATCCATGCCGCTGCCCGTTGCGCTGCA-3 ; SEQ IN NO:3
[0046] 5;-ATAAGAATGCGGCCGCTCAATCCTGCTGCTTGGTTC-3 ; SEQ IN NO:4
[0047] PCR扩增反应体系为： 10X扩增缓冲液 5μ1 lOmMdNTP 混合液 ΙμL 上游引物（10μΜ) 2μ1
[0048] 下游引物（ΙΟμΜ) 2μ1 模板 DNA (500ng) ΙμL DNA聚合酶 Ι μL 加入灭菌蒸馏水补足体系总量50μ1。
[0049]
[0050]
[0051]
[0052] 1.2然后以含有WT序列的重组质粒为模板，设计定点突变的引物，设计的引物为： 上游引物为SEQ ID Ν0:5所示的核苷酸序列，下游引物为SEQ IN Ν0:6所示的核苷酸序列； [0053]利用聚合酶链式反应的方法，在原有PQBP1序列的463-464bp位置插入AG俩个碱 基，简称M3;同时以SEQ ID N0:7所示的核苷酸为上游引物，SEQ IN N0:8所示的核苷酸为下 游引物，进行定点突变，在同样的位置去除一对AG碱基，以获得的移码突变多肽作为实验对 照（简称NC，negative control)。