用于治疗糖尿病的修饰的ingap肽的制作方法
【专利说明】
[0001 ] 优先权要求
[0002] 本申请要求2013年2月15日提交的美国临时专利申请第61/765,203号的优先权， 其内容被明确地引作参考。
技术领域
[0003] 本发明涉及用于治疗和预防糖尿病的具有胰岛辟田胞新生或再生活性的INGAP肽 及其组合物和方法。
【背景技术】
[0004] 糖尿病影响了全世界超过1亿的个体。在美国，那些被糖尿病影响的患者的估计的 医疗费用为大约每年1360亿美元。糖尿病为新陈代谢紊乱，其具有胰腺不能分泌足够量的 胰岛素的特点，其引起血糖水平的大波动并且既具有短期又具有长期的生理后果。在患有1 型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病或IDDM)的患者中起因于升高的血糖水平(高血糖症）的长 期并发症包括视网膜病、神经病、肾病和其他血管并发症。低的血糖水平(低血糖症)会导致 糖尿病昏迷、癫痫发作、意外事件(accidents)、缺氧、脑损害、认知功能下降和死亡。
[0005] 2型糖尿病，也已知为非胰岛素依赖型糖尿病或NIDDM，是一种进行性疾病，其具有 受损的葡萄糖代谢的特点，该受损的葡萄糖代谢引起升高的血糖水平。患有2型糖尿病的患 者呈现出受损的胰腺β细胞功能，该受损的胰腺β细胞功能引起在对高血糖信号做出响应 时，胰腺辟田胞不能分泌合适量的胰岛素；以及在它的靶组织中对胰岛素作用的抵抗(胰岛 素抵抗）。
[0006] 现在2型糖尿病的治疗目的在于逆转胰岛素抵抗，控制肠葡萄糖的吸收，正常化肝 脏葡萄糖的生产和提高辟田胞葡萄糖感知以及胰岛素分泌。因为现在糖尿病治疗的缺点，1 型和2型糖尿病的新疗法以及新的诊断和预后方法是亟需的。
[0007] 越来越多的证据表明不足的辟田胞团构成1型和2型糖尿病的起因。因此，在糖尿病 患者中细胞的再生是糖尿病研究的重要目标。近些年，有越来越多的兴趣在开发诱导辟田 胞再生和新的胰岛原位形成的新策略上（Baggio，L. L.和Drucker，D. J .，2006，Annu Rev Med ,57:265-281 )。因此，具有刺激剩余的β细胞团扩大的能力或具有胰岛新生活性的生物 活性分子的鉴定对于控制原生胰腺(native pancreas)的再生潜能是关键性的。
[0008] 胰岛新生相关蛋白（INGAP)是最初在部分阻塞的仓鼠胰腺的粗提物中发现的一种 16.8kDa蛋白（Rosenberg，L.等人，1988，Diabetes,37:334-341;美国专利第5,834,590号）。 INGAP在胰腺和十二指肠中表达，并且在几个物种中已经表现出诱导胰岛新生(Rosenberg, L.等人，1996 ,Diabetologia,39: 256-262 ;Rosenberg,L.等人，2004,Ann Surg 240 :875-884)。在结构上，INGAP是分泌的C型外源凝集素 Reg家族的一员，该家族含有多于25个成员， 基于一级序列被分为4个亚家族（21^1^，￥.￥.等人，2003，￥〇1'1(116381：1'〇611丨61'〇1，9:2635-2641;0kamoto，H.，1999，J Hepatobiliary Pancreat Surg 6:254-262)。
[0009] INGAP属于大的Reg 3亚家族，其已经在大鼠、小鼠、仓鼠和人的主要胃肠组织(胰 腺、胃、肝脏）中被识别（Rafaeloff，R.等人，1997，J Clin Invest 99:2100-2109)。尽管Reg 蛋白普遍存在，但是关于它们的功能或作用机制知道的不太多。虽然Reg 1被认为是辟田胞 促分裂原，但是关于Reg 3家族的功能知之甚少。
[0010]大量研究提示Regs可以结合特异性细胞表面受体并激活多个信号通路。支持这个 受体假说的一个论点是INGAP的生物活性看起来是由该蛋白的一个15个氨基酸片段(氨基 酸104-118)介导的，即INGAP肽（INGAP-P)，其由高度保守的IGLHDP基序和在Reg家族的其它 成员中没有被发现的单一序列SHGTLPNGS组成(Rafaeloff，R.等人，1997, J Clin Invest 99:2100-2109)。合成的INGAP肽已经被证明在仓鼠和小鼠中诱导新的胰岛形成和逆转链脲 霉素诱导的糖尿病上如所述蛋白质一样有效(Rosenberg，L.等人，1996, Diabetologia, 39: 256-262;Rosenberg，L·等人，2004，Ann Surg 240:875-884)，并且因此是所述受体的可能 配体。合成的INGAP-P的生物效应在体外和体内均被广泛研究。至今，已经显示INGAP-P: 1) 在从去分化的、胰岛来源的导管样结构诱导功能性的人胰岛的体外再生(Jamal，A.M.等人， 2005，Cell Death Differ ,12:702-712); 2)剂量依赖地刺激啮齿目动物、狗和食蟹猴中β细 胞团的扩大（Lipsett，M.等人，2007，Cell Biochem Biophys，48:127-137;Pittenger，G.L. 等人，2007，Pancreas，34:103-111)和3)增加胰岛素的分泌和β细胞尺寸以及在体外上调大 鼠新生胰岛中与β细胞功能相关的几种基因的表达(Barbosa，Η.等人，2006，Regul Pept， 136:78-84 ;Borelli，M. I ·等人，2005，Regul Pept, 13 1:97-102)。这些重要的结果跟随有 临床试验以研究它在人中的功效和安全性，其中INGAP-P被发现有改善葡萄糖动态平衡的 信号效果，其被在患有2型糖尿病的患者中在90天中糖基化血红蛋白（HbAlC或A1C)减少和 在患有1型糖尿病的患者中C-肽分泌的显著增加所证实(Dungan，K.M.等人，2009，Diabete S Metab Res Rev,25:558-565)〇
[0011]尽管这些数据提示INGAP-P既具有胰岛新生活性又具有促胰岛素活性，从动物研 究和人类实验显而易见INGAP(INGAP-P)的15-mer缺乏稳定性。相应地，为了达到所要求的 血清和组织阈值水平，必须以非常大的剂量给药。不良的稳定性也导致(比如)药物制剂、局 部注射部位反应的患者接受和高费用的问题。因此，存在与INGAP-P相比具有可比的或更大 的体内生物活性和/或更大的稳定性或更长的半衰期的INGAP类似物的需要。
【发明内容】
[0012]以前我们识别了一种叫做胰岛新生相关蛋白（INGAP)的胰腺蛋白，该蛋白是REG3 蛋白的跨种哺乳动物家族的一员（参见图19)，并且可以诱导胰岛再生仓鼠模型中的导管细 胞分化为β胰岛细胞(Rosenberg，L·等人，J Surg Res，1983，35:63-72;Rosenberg，L·等人， Diabetes，1988，37: 334-341 ;Rosenberg，L.等人，Diabetologia, 1996，39: 256-262)。一种 含有氨基酸104-118的INGAP蛋白的15-mer肽片段(INGAP-P)被确定为INGAP的生物活性中 心。
[0013] INGAP和INGAP-P均被证明能诱导导管细胞分化为胰岛。在人的胰岛再生体外模型 中，INGAP-P诱导胰腺发育转录因子PDX-1的增强表达和新的胰岛的同时形成(Jamal，A.M. 等人，Cell Death Differ.，2003，10:987-996;Jamal, Α·Μ·等人，Cell Death Differ·, 2005，12:702-712)。在动物模型中，INGAP-P诱导导管细胞体外增殖和胰岛细胞从与导管上 皮相关的细胞的再生，导致在正常成年小鼠、仓鼠和狗的胰腺中新的胰岛形成。在STZ(链脲 佐菌素)处理的糖尿病C57BL/6J小鼠模型中，INGAP-P逆转了糖尿病症状(Pittenger，G.L. 等人，Pancreas ,2007,34:103-111; Rosenberg，L ·等人，Ann · Surg ·，2004，240 :875-884 (2004) ;Kapur，R.等人，INGAP Induces Duct Cell Proliferation In Vitro and beta Cell Formation in Normal Non Diabetic Mice,71st ADA Meeting,圣地亚哥，2011)。在 已建立的（不是新开始的）自身免疫的1型糖尿病(T1DM)的NOD小鼠模型中，与免疫调节剂 IL-12抑制剂利索茶碱结合的INGAP-P诱导高血糖症的减轻并根除了对胰岛素颗粒的需要 (Tersey，S.A.等人，Unique Drug Combination for Reversal of Type IDiabetes,68th Scientific Sessions American Diabetes Association(ed.ADA)，旧金山，加利福尼亚， 2008;Tersey，S.A.等人，Journal of Diabetes Mellitus,2012,已付印）。组织学检查证实 了新的胰岛的证据。
[0014] 在人类实验中，INGAP-P已经在1型糖尿病(T1DM)患者和2型糖尿病(T2DM)患者的1 期和2期研究中被评价(Dungan，K.M.等人，Diabetes Metab Res Rev,2009,25:558-565)。 每日一次INGAP-P注射3个月引起在T1DM患者中所刺激的C-肽分泌在统计学上的显著增加 以及在T2DM患者中增加的C-肽水平的趋势。糖基化血红蛋白（HbA lc)在T2DM患者中-0.6 % (p 〈0.0125)的减少并在T1DM患者中-0.4% (p〈0.06)的减少。
[0015]尽管这些高度有希望的结果，INGAP-P的相对短的血浆半衰期继续表现出对于 INGAP-P作为治疗药的用途的挑战。
[0016] 相应地，本文提供保留INGAP-P的一种或多种生物活性并且适于作为治疗药开发 的INGAP肽。在一个实施方式中，本发明的肽具有与INGAP-P相比可比的或更大的体内生物 活性和/或更大的稳定性或更长的半衰期。
[0017] 在一个实施方式中，本文提供包含SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6所示的序列的肽。 [0018]在另一个实施方式中，本文提供由SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6所示的序列组成的 肽。
[0019] 在一些实施方式中，本发明的肽诱导胰腺辟田胞新生，诱导胰腺辟田胞再生，提高葡 萄糖动态平衡和/或逆转个体中的高血糖症。
[0020] 本文还提供本发明的肽的类似物、同系物、片段或变体，其中所述类似物、同系物、 片段或变体具有所述肽的生物活性。类似物、同系物、片段或变体可以具有与本发明所述肽 的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。所述生物 活性可以是(比如)所述肽的细胞或受体结合特异性、诱导胰腺β细胞新生的能力、诱导胰岛 细胞再生的能力、改善葡萄糖动态平衡的能力和/或逆转个体中高血糖症的能力。
[0021] 也提供含有编码本发明的肽或其类似物、同系物、片段或变体的核酸序列的核酸 分子。核酸分子可以可操作地连接到一个表达控制序列以形成一个表达载体，其中所述表 达载体在合适的细胞中增殖。
[0022] 也提供包含本发明的肽或其类似物、同系物、片段或变体以及药学上可接受的载 体或赋形剂的药物组合物。在一个实施方式中，组合物被改为适于口服。在另一个实施方式 中，组合物被改为适于通过注射给药。
[0023] 在另一个实施方式中，提供包括对需要其的个体给药本发明的肽或其类似物、同 系物、片段或变体或组合物的预防或治疗胰腺症状或疾病的方法。在一个实施方式中，所述 症状或疾病为新陈代谢紊乱。在另一个实施方式中，所述症状或疾病为细胞相关的紊乱。 在更进一步的实施方式中，所述症状或疾病为1型糖尿病、2型糖尿病或糖尿病的并发症。
[0024] 在一些实施方式中，由凋亡或坏死引起的辟田胞死亡在个体中通过给药本发明的 肽或其类似物、同系物、片段或变体或组合物被阻止或抑制。在其他实施方式中，个体中的 胰腺细胞的功能被改善或恢复，个体中的血浆胰岛素水平是增加的，个体中的胰腺β细胞的 量或尺寸是增加的，个体中胰腺导管细胞来源的β细胞再生是被刺激的，个体中的葡萄糖动 态平衡被恢复或改善和/或个体中的高血糖被逆转。
[0025] 本发明的肽和组合物可以通过注射、口服、静脉内、腹膜内、肌肉内或皮下给药。在 一个实施方式中，肽和组合物是口服给药的，每天一次。
[0026] 在一个特别的实施方式中，个体为人。
[0027] 在一些实施方式中，本发明的肽是与第二治疗剂给药的。第二治疗剂可以与本发 明的肽伴随给药，或第二治疗剂和肽可被顺序给药。在一个实施方式中，第二治疗剂对于1 型或2型糖尿病是治疗性的。在另一个实施方式中，第二治疗剂为阿那白滞素。
[0028] 还提供了用于治疗胰功能不全的药物组合物，该组合物含有本发明的肽和药学上 可接受的载体或赋形剂。在一个实施方式中，肽或组合物能刺激胰腺导管细胞来源的β细胞 再生。在另一个实施方式中，肽或组合物具有哺乳动物INGAP蛋白的生物活性。在一个实施 方式中，生物活性是刺激胰腺导管样细胞或导管相关的细胞生长和增殖的能力。
[0029] 还提供了编码本文描述的本发明的肽或其类似物、同系物、片段或变体的核酸分 子。核酸分子可以（比如)被连接到一个表达控制序列以形成一个表达载体，其中所述表达 载体在合适的细胞中增殖。
[0030] 在又一个实施方式中，本发明提供含有本文描述的肽或其类似物、同系物、片段或 变体以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
[0031] 本文还提供用于预防或治疗胰腺症状或疾病的方法，该方法包括对需要其的个体 给药本发明的肽或其类似物、同系物、片段或变体。在本文提供的方法中，个体可以是（比 如)啮齿目动物、犬科动物、猪、灵长目动物或人。
[0032] 在一个实施方式中，症状或疾病为新陈代谢紊乱，比如细胞相关的紊乱。症状或 疾病可以是1型糖尿病、2型糖尿病或糖尿病的并发症。
[0033] 在另外的实施方式中，个体中的β细胞凋亡被阻止或抑制;个体中的胰腺细胞的功 能被改善或恢复;个体中的血浆胰岛素水平增加;和/或个体中的胰腺细胞的数量或尺寸增 加。在一个具体的实施方式中，所述胰腺细胞为β细胞。
[0034] 在又一个实施方式中，辟田胞新生被刺激和/或个体中的葡萄糖动态平衡改善和/ 或个体中的胰岛素是增效的。
[0035] 附图简述
[0036] 本发明的【具体实施方式】现在会通过实施例和参考随附的附图的方式被解释。
[0037]图1显示了RIN-m5F细胞中INGAP在增殖上的效果。（A):INGAP增加了溴脱氧核苷尿 嘧啶(BrdU)掺入。在小室载玻片上用指示量的INGAP-P或r-INGAP处理RIN-m5F细胞24小时。 Exendin 4(Ex4)和表皮生长因子(EGF)用作对照。在处理的最后三小时加入50μΜ BrdU，接 着在甲醇中固定和进行BrdU免疫染色。数据以INGAP处理的比未处理的对照中BrdU( + )细胞 的比例（％)进行表示。结果是3个独立实验的平均值土标准误差（S.E.)(*:p〈0.05，§:p〈 0.001，与未处理的对照相比）。（B): INGAP诱导RIN-m5F中Erk 1 /2的磷酸化。用INGAP处理接 种在60mm组织培养板上的RIN-m5F细胞（1 X 106)，持续指示的时间。用抗Erkl/2磷酸 (Thr202/Tyr204)抗体探测印迹（30yg蛋白质），接着清除/用抗总Erkl/2抗体（Cell Signaling)再探测，并使用ImageJ软件通过密度计量学定量。（C):量化相对的Erkl/2磷酸 化，该相对的Erkl/2磷酸化作为磷酸Erkl/2对总Erkl/2的比例被测定，并表示为相对于 Omin时间点的倍数变化。结果是3至8个独立实验的平均值土标准误差: p〈0.05，§ : p〈 0.01，1: P〈〇. 〇〇 1; t:仅针对所示的时间点，进行两个实验）。
[0038]图2显示了荧光标记的rINGAP在细胞表面形成帽（cap)。接种在小室载玻片上的 RIN-m5F细胞在37°C或在冰上用50nM经DyLight 488活性染料标记的rINGAP孵育所示的时 间，并于冰上在4%多聚甲醛中固定。（A):在冰上预冷细胞15min，并与rINGAP和CTB (AlexaFluor-594，5μg/ml，Invitrogen)孵育30min。（B):同样地用转铁球蛋白（25μg/ml， Texas Red, Invitrogen)。（C)、（D) :37°C下分别用CTB和转铁球蛋白孵育lh。（E)、（F):用标 记的rINGAP将细胞孵育5h或24h，并在最后一小时用50nM LysoTracker Red DND99(LT, Invitrogen)共染色。细胞核用包含在封固剂(Prolong Gold, Invitrogen)中的DAPI复染。 用奥林巴斯FVlOi共聚焦显微镜获取图像。标尺为20μπι。
[0039] 图3显示了荧光标记的rINGAP的结合和内化被100ηΜ的渥曼青霉素和细胞松弛素 D 部分抑制，提示巨胞饮(macropinocytosis)。在渥曼青霉素（100nM)或细胞松弛素 D(25yg/ ml)存在下，接种在小室载玻片上的RIN-m5F细胞用50nM经DyLight 488活性染料标记的r-INGAP孵育5h，并在4%多聚甲醛中固定。(A) :rINGAP，没有抑制；（B):阴性对照；（C):渥曼青 霉素；（D):细胞松弛素 D。细胞核用包含在封固剂(Prolong Gold, Invitrogen)中的DAPI复 染。用奥林巴斯FVlOi共聚焦显微镜获取图像。
[0040] 图4显示了 FAM标记的INGAP-P被快速地内化到RIN-H15F细胞的细胞质。用FAM标记 的INGAP-P将生长在小室载玻片中的细胞处理指示的时间，并用4%PFA固定。(A)、（B)、(D)、