胆酸修饰的聚氨基酸嵌段共聚物的合成及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种胆酸修饰的聚氨基酸嵌段共聚物，具体涉及一种聚氨基酸及在聚 氨基酸末端修饰胆酸，侧链用硫辛酸修饰的两亲性嵌段聚合物。
【背景技术】
[0002] 聚合物胶束是由两亲性聚合物通过分子间的相互作用（氢键、亲/疏水作用及范 德华力等）在水溶液中自组装得到。是以疏水基团为内核、亲水基团为外壳的通过自组装 形成的分子有序聚集体。聚合物胶束除了具有纳米药物载体的一些常见优点之外，还有相 对其他纳米载体而言（如脂质体和聚合物纳米粒）更为优越的物理和生化性能：具有明显 的核壳结构，其中疏水核部分可用来包裹疏水药物，亲水壳可以使得胶束在水溶液中具备 优越的稳定性；可以有效减少人体网状内皮系统（RES)巨噬细胞的吞噬，能穿越细胞间隙， 可通过人体最小的毛细血管及血脑屏障（BBB)并被细胞组织吸收；增强的水溶解度和生物 利用度；延长药物的循环时间，减少副作用；纳米胶束药物载体可以达到靶向输送的目的 并能控制药物释放，有利于药物对一些特殊部位的治疗。纳米胶束的诸多优点，使其在药物 的控制释放上具有巨大应用前景。
[0003] 将末端官能化的亲水链段作为大分子引发剂对单体进行开环聚合反应是制备两 亲聚合物的主要方法之一。常见的亲水主链包括聚乙二醇（PEG)或聚磷酸酯（PEEP)等。常 用的可生物降解的疏水链段有聚氨基酸（如聚β-苯甲酰-L-天冬氨酸、聚γ-苄基-L-谷 氨酸和聚天冬氨酸等）。作为亲水主链，聚乙二醇（PEG)是pH中性、无毒、水溶性、无抗原性 和免疫原性的聚合物，其具有优越的水溶性和良好的生物相容性及血液相容性，作为胶束 的外壳，可以避免载药系统在网状内皮系统中的识别和蛋白质的吸附，从而延长了载药系 统在血液中的循环时间，提高了药物的生物利用度。作为疏水链段，天然的及合成的聚氨基 酸具有良好的生物相容性，其代谢产物对人体无害；就氨基酸材料而言，其为人体必需，能 自行降解、代谢而被机体吸收和排泄，具有其他的材料无法超越的优点。已有聚氨基酸材料 用作缝合线材料，人工皮肤等，在药物降解、抗肿瘤药物控释等领域已被广泛的应用。
[0004] 胆酸是人体内主要的胆汁酸，其存在于人体内，已有报道表明胆酸的修饰可以明 显增加聚合物的载药量及包封率，而且已经成功地运用于药物释放。
[0005] 然而两亲聚合物通过自组装形成的胶束往往不够稳定，注入体内被血液大量稀释 而发生解离，或与存在于血液中的细胞和生物分子相互作用造成药物过早释放，不能将药 物输送至靶向位点。交联可以有效提高胶束稳定性。近年来，具有环境（PH、温度，氧化还原 环境等）响应性的纳米载体成为研究热点（Sang Cheon Lee，et al. Biomaterials 2012， 33 :1489-1499 ;Chen et al，Journal of Controlled Release，2013,69 :171-179)。二硫 键交联的胶束具有优越的生物相容性，在生理环境下抑制药物释放，在体内非常稳定能长 循环，进入细胞后，能对体内环境具有响应性而解除交联，将药物释放出来，从而产生了较 高的抗肿瘤活性。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种两亲嵌段聚合物的制备及应用的方法。
[0007] 为达到上述目的，本发明具体技术方案是胆酸修饰的聚氨基酸嵌段共聚物的合成 及应用，所述嵌段共聚物的主链由亲水段和疏水段组成，疏水段末端修饰胆酸小分子，疏水 段侧链为硫辛酰基。
[0008] 上述技术方案中，所述亲水聚合物可选用的原料为本领域技术人员公知的原料， 所述亲水性聚合物可选自但不限于：聚乙二醇（PEG)、聚磷酸酯中的一种；所述的两亲性聚 合物的分子量为5000~30000。
[0009] 上述技术方案中，所述胆酸修饰的聚氨基酸嵌段共聚物的疏水段侧链包含硫辛酰 基。
[0010] 制备上述两亲性聚合物的方法为本领域技术人员公知的技术，以聚乙二醇-聚 (氨基酸-硫辛酸）-胆酸（PEG-pGlu (EDA-LA) -CA)的制备为例来说明胆酸修饰的两亲性嵌 段聚合物的制备方法，聚乙二醇-聚氨基酸通过开环聚合反应方便得到：首先用PEG-NHjt 为大分子引发剂，开环BLG-NCA，然后在聚氨基酸末端连上胆酸，再对聚氨基酸部分进行胺 解，连上硫辛酸，其合成路线如图1所示。
[0011] 上述技术方案中，所述聚氨基酸嵌段共聚物中硫辛酰基的数目可通过加入的聚乙 二醇与BLG-NCA的比例、反应时间、反应温度等来调节。
[0012] 上述技术方案中，将硫辛酰基引入疏水聚合物聚氨基酸的侧链，得到的两亲性聚 合物，通过自组装形成纳米胶束，然后通过还原剂如1.4-二硫代苏糖醇（DTT)对硫辛酰基 的五元环进行交联，来增加纳米胶束的稳定性，形成交联纳米胶束，这种交联纳米胶束对 细胞内的还原环境具有响应性，能解除交联。
[0013] 上述技术方案中，聚氨基酸末端修饰的胆酸可以增加胶束核的疏水面积，从而增 加载药量。
[0014] 本发明的另一目的为提供一种交联纳米胶束。
[0015] 为达到上述目的，本发明具体技术方案是，一种交联纳米胶束，所述纳米胶束的亲 水层由亲水性聚合物构成，疏水层由胆酸和聚氨基酸构成，聚氨基酸侧链的硫辛酰基可以 交联。
[0016] 上述技术方案中，所述交联纳米胶束的粒径为100~150纳米，粒径分布PDI为 0. 10 ~0. 25^
[0017] 制备上述交联纳米胶束的方法包括以下步骤：
[0018] (1)将上述胆酸修饰的两亲性嵌段聚合物通过自组装形成纳米胶束，所述纳米胶 束的亲水外层由聚乙二醇构成，疏水层由小分子胆酸和聚氨基酸及硫辛酰基构成；
[0019] (2)将步骤（1)中纳米胶束的核交联，通过对硫辛酰基的五元环的交联来稳定纳 米胶束结构，得到交联纳米胶束。
[0020] 上述技术方案中，步骤（1)中所述两亲聚合物在水中自组装形成以硫辛酰基修饰 的聚氨基酸为疏水部分的尺寸稳定，分布均一的纳米胶束，所述纳米胶束的粒径为100~ 150nm〇
[0021] 上述技术方案中，步骤（2)中所述的交联可采用但不局限于下列方法：
[0022] 利用疏基-二硫键交换（thiol-disulfide exchange)反应，通过1，4-二硫代苏 糖醇（DTT)对步骤（1)所得纳米胶束中的含二硫键的五元环进行化学交联；其中，1，4-二 硫代苏糖醇（DTT)的用量是聚合物中的硫辛酰基的摩尔数的10%，纳米胶束能够被成功交 联。
[0023] 上述技术方案所得交联纳米胶束的稳定性相对于没有交联的纳米胶束大大提高， 即使稀释1000倍（模拟IV注射）也不发生解离；对150mM和2M的氯化钠的水溶液稳定， 粒径和分布变化不大；对有机溶剂如二甲亚砜稳定，在一定范围内粒径只是稍有变大。
[0024] 上述技术方案所得交联纳米胶束在还原环境中可以发生解交联，用来解 交联的还原剂可选自但不限于：含疏基的分子，如1，4_二硫代苏糖醇（DTT)，谷 胱甘肽（GSH)或含三价磷的化合物，如磷酸三丁酯（Bu 3P)三（2-氯乙基）磷酸酯 (tris(2_carboxyethyl)-phosphine，TCEP);例如当 DTT 的浓度为 10mM 的时候，上述交联 纳米胶束会被解交联。
[0025] 因为上述交联纳米胶束具有还原敏感性，所以可以应用所述交联纳米胶束作为药 物载体，两亲性嵌段聚合物末端修饰胆酸可提高交联纳米胶束对药物的包载效率，提高交 联纳米胶束在体内血液中循环的稳定性，提高交联纳米胶束被肿瘤细胞内吞的效率，从而 提高药物的生物利用度，同时交联纳米胶束可方便排除体外。
[0026] 本发明的另一目的为提供上述交联纳米胶束的应用，所述交联纳米胶束作为药物 载体的应用。
[0027] 为达到上述目的，本发明的具体技术方案为，应用上述胆酸修饰的两亲性聚合物 作为药物载体的方法，包括以下步骤：
[0028] (1)药物先溶在有机溶液中，再与所述两亲聚合物的有机溶液共同搅拌，然后再滴 加二次水，将得到的溶液搅拌0. 5小时后透析24小时，得到包裹药物的纳米胶束；
[0029] (2)对形成的纳米胶束加入lOmol %相对于双硫键的1，4-二硫代苏糖醇（DTT)进 行交联得到包裹药物的交联纳米胶束。
[0030] 上述技术方案中，所述药物可选自但不局限于：疏水性药物中的一种。本领域技术 人员可以根据需要选择所需包封的药物分子。
[0031 ] 进一步技术方案中，为了解决药物释放中载体的细胞穿透/渗透性差的问题，通 常可以通过受体介导的细胞内吞（receptor mediated endocytosis)来促进细胞摄取。受 体介导的细胞内吞一般通过生物靶向分子如单抗、多肽（如RGD)和叶酸的主动靶向来实现 细胞内吞，从而增加药物的生物利用度。
[0032] 以PEG-pGlu (EDA-LA) -CA为例，首先通过PEG-NH2开环聚合BLG-NCA得到两亲性 聚合物，聚氨基酸末端进行酯化反应连上胆酸，用乙二胺对聚氨基酸中的苄氧羰基部分进 行胺解，再经过酰胺化反应连上硫辛酸。
[0033] 优选的技术方案中，PEG-pGlu (EDA-LA)-CA，其中，PEG溶于水和许多溶剂中，且该 聚合物有优异的生物相容性，能被机体迅速排除体外而不产生任何毒副作用，还具有易于 改性的优点；聚氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋 白质的基本物质。聚氨基酸能在体内酶的作用下降解为氨基酸，生物相容性好，且安全无 毒，聚氨基酸的研究已受到广泛的关注。聚氨基酸是一类低毒、生物相容性好、容易被机体 吸收、代谢的生物降解高分子，聚氨基酸与药物通过化学键形成偶联物，在体内酸性环境及 酶的作用下化学键断裂释放药物，达到缓释、靶向的作用，并且可以降低药物的毒性。硫辛 酸是FDA批准的一种内源性的抗氧化剂，可以去除机体自由基，降低血糖。因此整个体系具 有非常优良的生物相容性。
[0034] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
[0035] (1)由于本发明的两亲性聚合物的疏水部分为聚氨基酸和胆酸，胆酸能增加胶束 中核面积，从来提高载药量，而聚氨基酸侧链连上硫辛酸，可以通过对两亲聚合物自组装形 成的纳米胶束进行核交联，得到稳定的交联的还原敏感的聚合物纳米胶束，该纳米胶束在 细胞外和血液中不易解离，从而保证纳米胶束包裹的药物稳定；克服了药物在体内提前释 放、运载效率低等不足。
[0036] (2) -旦进入肿瘤细胞，纳米胶束快速解交联而解离，药物快速释放出来，从而产 生高效治疗作用。
【附图说明】 图1是胆酸修饰的聚氨基酸嵌段共聚物PEG-pGlu(EDA-LA)-CA的合成路线图； 图2是PEG-pGlu (EDA-LA) -CA载药交联胶束的制备，及其在