Fgf19通过抑制胆汁酸合成发挥抗炎作用的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及重组蛋白质药物，具体涉及人重组蛋白FGF19通过CYP7A1介导的胆汁酸合成发挥抗炎作用的应用。本发明公开了人重组蛋白FGF19可用于制备治疗伴有胆汁酸蓄积的各种炎性肠病的药物的应用。在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，FXR-FGF15胆汁酸合成负反馈机制失灵导致胆汁酸显著蓄积；给予人重组FGF19可以显著的制肝脏CYP7A1的mRNA表达和蛋白含量，制肠炎所诱导的胆汁酸蓄积，FGF19可以显著减轻DSS所诱导的肠炎的症状。FGF19有望为治疗伴随胆汁酸蓄积的炎性肠病的治疗带来重大突破。
【专利说明】FGF19通过抑制胆汁酸合成发挥抗炎作用的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及重组蛋白质药物，具体涉及人重组蛋白FGF19通过抑制肝脏CYP7A1介导的胆汁酸合成发挥抗炎作用的突破性进展。
【背景技术】
[0002]鉴于胆汁酸的促炎活性和致癌活性，体循环中的胆汁酸水平需得到严密的调控以使之保持在生理浓度范围内。正常情况下胆汁酸可以通过作用于相关核受体有效的调节自身的合成和转运，以及胆固醇与脂质代谢的稳态平衡。已有临床试验表明，10% -30%的慢性肠炎(IBD)患者会伴随不同程度的胆汁淤积，总胆汁酸水平与肠道炎症存在相关性。这些实事均说明胆汁酸蓄积在慢性肠炎的发生过程中起到了重要作用。
[0003]成纤维细胞生长因子19(FGF19)可以通过抑制肝脏胆汁酸合成限速酶CYP7A1的基因表达调控胆汁酸合成，其基因表达收到核受体FXR的直接调控。小鼠FGF15是人FGF19的同源蛋白，FGF15\19被证实是由回肠上皮细胞分泌，通过肝门静脉血入肝，结合于肝脏表达的异源二聚体受体FGFR4/ β —Klotho,激活JNK信号通路从而抑制CYP7A1的表达。已有研究表明，FGFR4、i3 —Klotho基因敲除小鼠胆汁酸库(Bile acid pool)均显著增加，说明FGF15\19在胆汁酸水平的调控中起重要作用。
[0004]基于IBD病人伴随胆汁酸显著蓄积的实验\临床事实，结合FGF19介导的胆汁酸合成负反馈调控的理论基 础，我们认为:FXR — FGF15\19介导的胆汁酸合成负反馈机制失灵所引起的胆汁酸蓄积是慢性肠炎进入非可控状态的重要因素和发病机理，FXR-FGF15\19通路有望成为治疗IBD的新切入点，人重组蛋白FGF19通过抑制胆汁酸合成发挥抗炎作用将为IBD的治疗带来重大突破。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提出肠道炎症新的致病机理并阐明FGF19抗炎机制和应用。首先我们通过硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导慢性结肠炎小鼠模型，研究小鼠在溃疡性结肠炎状态下，胆汁酸水平是否发生变化，结果发现DSS肠炎小鼠总胆汁酸库增加。根据qRT — PCR实验考察介导胆汁酸合成的酶的mRNA的表达，结果发现，DSS肠炎小鼠肝脏胆汁酸合成限速酶CYP7A1的mRNA表达显著上调，说明胆汁酸合成增加。通过qRT—PCR技术以及免疫组化技术进一步发现，CYP7A1上调是由于介导胆汁酸负反馈的FXR — FGF15通路在肠炎小鼠中受到了显著的抑制。这说明回肠FXR-FGF15通路的抑制诱发了胆汁酸合成的增加，并有可能导致毒性胆汁酸在体内的蓄积以及疾病的进一步恶化。因此，基于这一理论依据，在DSS肠炎模型基础上，给予人重组FGF19恢复负反馈调节作用，结果发现，0.025mg/kg给药剂量的FGF19能抑制肝脏CYP7A1的mRNA水平和蛋白含量、恢复胆汁酸稳态平衡，进一步考察炎症相关病理学指标，证实人重组FGF19可以有效抑制DSS诱导的小鼠肠炎症状。
【专利附图】
【附图说明】[0006]图1:A，DSS诱导小鼠结肠炎症(H&E染色，200倍)及组织学评分。B，DSS肠炎小鼠结肠部位炎症因子11-6，Il-1 β，Tnf-α的mRNA表达增加。*ρ〈0.05，#ρ〈0.01，肠炎组(DSS)与对照组(Control)相比。
[0007]图2:A，DSS肠炎小鼠胆汁酸肝脏合成限速酶CYP7A1的mRNA表达和B，蛋白含量增加。C，DSS肠炎小鼠总胆汁酸库增加。*ρ〈0.05，#ρ〈0.01，肠炎组(DSS)与对照组(Control)相比。
[0008]图3:A，DSS肠炎小鼠FXR — FGF15负反馈通路相关基因表达受到抑制。B,回肠FXR及FGF15免疫组化。*ρ〈0.05，#ρ〈0.01，肠炎组(DSS)与对照组(Control)相比。
[0009]图4:A，人重组FGF19能抑制DSS诱导的小鼠结肠炎。A，病理指标:体重变化、结肠长度。B，H&E染色，200倍。C，结肠部位炎症因子11-6，Il-1 β , 11-10的mRNA表达。*p〈0.05, **p〈0.01。
[0010]图5:人重组FGF19能恢复DSS肠炎状态下负反馈机制。A，肝脏负反馈通路相关基因Fgfr4, β -Klotho, Shp, Fxr的mRNA表达。B,抑制DSS所诱导的CYP7A1的mRNA表达及蛋白含量的增加，使总胆汁酸库恢复到正常水平。*P〈0.05，**p〈0.01。
【具体实施方式】
[0011]实施例1.DSS诱导慢性结肠炎小鼠模型
[0012]实验材料:
[0013]SPF级雄性C57BL/6小鼠18 — 20g(5周龄)，购白上海斯莱克实验动物有限公司；硫酸葡聚糖(DSS，36000— 50`000)购白MP公司。
[0014]实验方法:
[0015]1.实验鼠需在标准化动物房环境中适应至少7天，给予标准动物饲料，饮用高压灭菌水，并及时更换垫料(每周2—3次)。
[0016]2.配置2.5% DSS溶液:使用高压灭菌水按照重量体积比配置2.5%配制DSS溶液，配制好的DSS溶液可在4C冰箱中存放一周。
[0017]3.实验开始后，按每只小鼠每天的饮水量5mL计算，每次在小鼠水瓶中倒入两天饮水量的DSS溶液，两天后如有剩余，应弃去，重新倒入新鲜的两天饮水量的DSS溶液。DSS饮水一个周期为7天。
[0018]4.于第8日早晨开始，用高压灭菌水代替2.5%DSS溶液给予模型鼠自由饮用，饮用周期为14天。
[0019]5.实验过程中，每两天记录模型小鼠的饮食、饮水量，并称量体重，观察有无血便产生。
[0020]6.以上的整个过程为一个循环，再重复2次上述循环，造模结束，整个造模周期为9周。对照组小鼠喝高压灭菌水，所有实验鼠给予标准饲料。
[0021]实施例2.人重组FGF19对DSS肠炎小鼠的治疗
[0022]实验材料:
[0023]人重组FGF19 (Bioworld Technology)
[0024]实验方法:
[0025]Img FGF19用ImL生理盐水溶解，并稀释至0.0025mg/mL作为给药浓度，给药体积为0.1mL/10g body weight。每天18:00给予“FGF19/DSS”治疗组小鼠腹腔注射FGF19，给药剂量为0.025mg/kg/d。疗程为每个DSS造模循环(7天DSS饮水+14天正常饮水)的前14天。同时，对照组和DSS模型组小鼠均腹腔注射生理盐水作为对照，0.lmL/10g bodyweight。
[0026]实施例3.总胆汁酸库的测定
[0027]实验材料:
[0028]小鼠总胆汁酸测定试剂盒(Crystal Chemistry) ?
[0029]实验方法:
[0030]小鼠8:00a.m.开始禁食4h后,称体重,处死,取肝肠循环(包括:肝、胆囊、小肠及内容物)作为胆汁酸库测定样本，按试剂盒说明测定总胆汁酸浓度，并用浓度/体重比值作为标准化数据。
[0031]实施例4.qRT—PCR基因表达检测
[0032]实验材料:
[0033]RNA提取试剂Trizol、反转录试剂购自Takara (大连宝生物)，SYBR Green试剂盒、Bio-Rad CFX 系列突光定量仪购自 Bio—Rad (Bedford, MA)。
[0034]实验方 法:
[0035]Trizol提取总RNA,测定RNA浓度及纯度。采用反转录试剂进行反转录。并与定量PCR仪Bio — Rad CFX Real Time System上进行实验。引物序列如表1所示。采用SYBRGreen试剂盒进行基因表达情况研究。采用三步法进行，反应体系为15 μ L，每个样品进行三次重复，数据处理采用Livak法半定量分析。定量PCR反应条件:
[0036]Stagel:预变性:95°C, 30sec。
[0037]Stage2:PCR 反应:95C，5sec ；Tm/60°C，15sec ；72C, 30sec，40Cycles。
[0038]Stage3:融解曲线分析:95°C, 15sec ；70C, 15sec。
[0039]表1.qRT—PCR引物序列
【权利要求】
1.FGF19通过抑制胆汁酸合成发挥抗炎作用的应用，所述炎症包括伴随胆汁酸蓄积的各种肠道炎症。
2.人重组蛋白FGF19发挥抗炎作用是通过抑制肝脏CYP7A1，恢复肠炎伴随的胆汁酸蓄积所介导。
3.人重组蛋白FGF19可用于制备治疗伴有胆汁酸蓄积的各种炎性肠病的药物的应用，其特征在于:通过恢复 总胆汁酸稳态水平可以有效的抑制肠道炎症。
【文档编号】A61P1/00GK103816533SQ201410067112
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】王广基, 郝海平, 曹丽娟, 邓珊珊 申请人:中国药科大学