是评估转基因作物释放对土壤微生态风险的重要基础，本发明提供的一种基于16SrDNA深度测序检测大豆根际土壤原核微生物的方法，为不同基因型大豆包括转基因大豆及其受体品种对根际土壤原核微生物群落影响的准确评估提供了一种新方法。该方法检测全面，操作简便，成本低，结果可靠。
【附图说明】
[0019]图1蒙豆12(M)和NZL06-698(N)大豆根际土壤(Rh)和根系抖落土壤(SO)高质量微生物宏基因组DNA的检测结果。
[0020]图2蒙豆12(M)和NZL06-698(N)大豆根际土壤(Rh)和根系抖落土壤(SO)中原核微生物ALPHA多样性分析结果。
[0021]图3蒙豆12(M)和NZL06-698(N)大豆根际土壤(Rh)和根系抖落土壤(SO)中原核微生物的主成分分析(PCA)结果。
[0022]图4蒙豆12(M)和NZL06-698(N)大豆根际土壤(Rh)和根系抖落土壤(SO)中原核微生物基于BETA多样性WEIGHTED-UNIFRAC的主关联分析(PCoA)结果。
[0023]图5蒙豆12(M)和NZL06-698(N)大豆根际土壤(Rh)和根系抖落土壤(SO)中超过99 %的主要细菌类别，在门(phyla)分类水平上相对丰度的差异分析。其中*，p〈0.05; **，p〈
0.0lo
[0024]图6蒙豆12(M)和NZL06-698(N)大豆根际土壤(Rh)和根系抖落土壤(SO)中超过95 %的主要细菌类别，在纲(classes)分类水平上相对丰度的差异分析。其中*，p〈0.05; **，
p〈0.01 ο
[0025]图7蒙豆12(M)和NZL06-698(N)大豆根际土壤(Rh)和根系抖落土壤(SO)中主要的共生与联合固氮菌群在属(genus)分类水平上相对丰度的差异分析。其中*，p〈0.05。
【具体实施方式】
[0026]1.大豆材料:蒙豆12 ;NZL06-698含EPSPS耐除草剂基因。
[0027]2.田间试验设计:
[0028]大田试验地点在吉林省公主岭市，每一种基因型大豆种植于三个或三个以上小区，每个小区面积不小于12m2(4mX3m)。每个小区有两个取样点，每个取样点取两棵或两棵以上植株。
[0029]3.样品采集
[0030]先除去地面杂草和枯枝落叶等，铲除大田土壤表面Icm左右的表土，然后将在盛花期(或苗期、鼓粒期、成熟期)的大豆植株连根从土中取出，用抖落法取根系抖落土作为系统对照，混合均匀并去除根毛等，于零下70°C保存(至少零下20°C保存)；然后用捋取法取下紧粘于大豆根的根际土壤，混合均匀并去除根毛等，并于零下70°C保存。
[0031]4.土壤样品中微生物宏基因组DNA的提取:
[0032]从上述各土壤样品中，用可去除土壤中残留的腐殖质及几乎所有其他的PCR抑制因子的PowerSoil DNA Isolat1n Kit(MoB1 Laboratories Inc.,Carlsbad,CA,USA)提取高质量微生物宏基因组DNA(图1)。
[0033]5.宏基因组DNA中16SrDNA的V4高变区文库的构建
[0034]用双标签融合引物对，其一含P5Illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物515F( 5 ‘ -GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3，)，另一引物含P711 Iumina接头序列、8核苷酸的标签以及806R(5‘-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，做PCR扩增所述宏基因组DNA中 16SrDNA的V4高变区片段以构建文库。
[0035]6.合格文库的高通量测序
[0036]对合格的文库用Illumina Miseq平台进行双末端250个核苷酸(PE250)边合成边测序的深度测序，并对边合成边测序的读取序列(READS)进行质量控制。
[0037]7.生物信息学内容分析
[0038]把纯净的成对READS拼接成TAG，然后聚类成“可操作分类学单元”(OTU);然后做ALPHA多样性、结构、组成及在不同分类水平上相对丰度差异的显著性分析等。
[0039]8.数据整合与比较分析
[0040]以根系抖落土壤(SO)原核微生物群落的ALPHA多样性(图2B)、结构(主成分分析，图3B;BETA多样性，图4B)、组成及在门分类水平上的相对丰度差异的显著性分析(图5B)、在纲分类水平上的相对丰度差异的显著性分析(图6B)以及在属分类水平上主要的共生及联合固氮菌群相对丰度差异的显著性分析(图7B)作为系统对照，克服土壤异质性的影响，准确测定根际土壤(Rh)原核微生物群落的ALPHA多样性(图2A)、结构(主成分分析，图3A;BETA多样性，图4A)、组成及在门分类水平上的相对丰度差异的显著性分析(图5A)、在纲分类水平上的相对丰度差异的显著性分析(图6A)以及在属分类水平上主要的共生及联合固氮菌群相对丰度差异的显著性分析(图7A)，比较不同大豆根际土壤原核微生物群落之间的异同。
【主权项】
1.一种基于16SrDNA深度测序检测不同大豆根际土壤原核微生物的方法，其特征是由以下步骤构成: (1)大田试验地设计，每一种基因型大豆种植于三个或三个以上小区，每个小区面积不小于12m2，每个小区有两个取样点，每个取样点取两棵或两棵以上植株； (2)先除去地面杂草和枯枝落叶，铲除大田土壤表面l-2cm的表土，然后将在盛花期或苗期或鼓粒期或成熟期的大豆植株连根从土中取出，用抖落法取根系抖落土作为系统对照，混合均匀并去除根毛，于零下20°C_零下70°C保存，再用捋取法取下紧粘于大豆根的根际土壤，混合均匀并去除根毛，并于零下70°C保存； (3)从上述各土壤样品中，用可去除土壤中残留的腐殖质及几乎所有其他的PCR抑制因子的PowerSoil DNA Isolat1n Kit提取高质量微生物宏基因组DNA; (4)用双标签融合引物对，其一含P5Illumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物515F，515F的核苷酸序列是5 ‘ -GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3，，另一引物含P711 Iumina接头序列、8核苷酸的标签以及特异性引物806R，806R的核苷酸序列是δ?ΟΟΑσΓΑαΜΧΧΠΤΓσΓΑΑΤ-β’ ，做PCR扩增所述宏基因组DNA中16S rDNA的V4高变区片段以构建文库； (5)对合格的文库用IlluminaMiseq平台进行双末端250个核苷酸边合成边测序的深度测序，并对边合成边测序的读取序列READS进行质量控制； (6)把纯净的成对READS拼接成TAG，然后聚类成“可操作分类学单元”，英语缩写为OTU，再做物种组成、结构、多样性及相对丰度差异的显著性分析； (7)以根系抖落土壤微生物群落的组成、结构及多样性作为系统对照，克服土壤异质性的影响，准确测定根际土壤原核微生物群落组成、结构、多样性、相对丰度，比较不同大豆之间的异同。2.根据权利要求1所述一种基于16SrDNA深度测序检测不同大豆根际土壤原核微生物的方法，其特征在于所述的系统对照为大田种植方式下的大豆根系抖落土壤，每种基因型大豆的系统对照土壤样品至少3个生物学重复;每种基因型大豆的根际土壤样品至少3个生物学重复。3.根据权利要求1所述一种基于16SrDNA深度测序检测不同大豆根际土壤原核微生物的方法，其特征在于所述的高质量宏基因组DNA用PowerSoiI DNA Isolat1n Kit提取，其中，土壤样品的均质化在康宁LSE祸旋混合器上以最大转速2850rpm运转10分钟完成。4.根据权利要求1所述一种基于16SrDNA深度测序检测不同大豆根际土壤原核微生物的方法，其特征在于所述的深度测序是在11 lumina Miseq平台上，以PE250模式做16S rDNA的V4高变区片段高通量测序，每个系统对照土壤样品DNA至少产出3.8万条有效TAG以用于聚类成OTU;每个根际土壤样品DNA至少产出13万条有效TAG以用于聚类成0TU。
【专利摘要】本发明属于土壤微生物学技术领域，具体涉及基于16SrDNA深度测序检测不同大豆根际土壤原核微生物的方法。该方法由以下步骤构成1.采集不同大豆在各发育时期的根系抖落土壤及根际土壤；2.从土壤中提取微生物宏基因组DNA；3.用双标签引物做PCR扩增上述DNA中16S？rDNA第四高变区,以构建文库；4.对合格文库用Illumina？Miseq平台做双末端250个核苷酸的边合成边测序，得到纯净READS；5.拼接，每样品产出至少3.8万条有效TAG用于聚类成可操作分类单元；6.物种组成、结构、多样性及相对丰度差异显著性分析；7.以根系抖落土壤作为系统对照，准确测定根际土壤原核微生物群落组成、结构、多样性、相对丰度，并比较不同大豆之间的异同。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105525025
【申请号】CN201610089583
【发明人】杨永华, 陆桂华, 戚金亮, 杨荣武, 庞延军, 朱银玲, 孔令如, 汤程贻
【申请人】南京大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年2月17日