牛肉制品中猪肉成分定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品检测领域，具体涉及牛肉制品中猪肉成分含量定量检测方法。
【背景技术】
[0002] 由于猪肉与牛肉、羊肉价格差别较大，近年来在经济利益的驱动下，以猪肉添加牛 肉香精、羊油、色素等添加剂冒充羊肉、牛肉及其制品的违法犯罪事件屡见不鲜。如浙江犯 罪团伙用猪肉生产假牛肉干，一年多制造销售达75吨；广州思味食品的"亿思"牌牛肉干以 猪肉和牛肉膏为原料，以假充真，两年销售2000万元；内蒙古不法分子猪肉冒充牛肉，添加 牛肉香精，将生产的假风干牛肉销往包头周边地区及陕西、宁夏等省市。这些事件损坏了消 费者的利益，甚至危害消费者身体健康。而且因穆斯林忌食猪肉，这些假牛羊肉也涉及到民 族和宗教问题。这些都严重动摇了消费者对食品行业的信心。
[0003] 由于经过色素、香精加工的猪肉纹理、色泽和气味与牛肉、羊肉相似，普通消费者 难以辨别，深加工过的假牛肉干等制品更是难以分辨。目前肉类成分鉴定的方法主要是根 据蛋白质成分和基因序列，如色谱、酶联免疫反应(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)法。目前 一些企业已经开发出猪肉蛋白质的ELISA检测试剂盒和试剂条，但这些试剂盒和试剂条检 测准确性不高。实时荧光PCR(real-time PCR)方法具有灵敏度、准确性高的优点，同时不需 要购买昂贵的试剂盒。目前肉类成分食品检测标准主要基于实时荧光PCR方法，如SN/T 3730.8-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第8部分猪成分检测实时荧光PCR 法》。
[0004] 但这些标准主要是对食品和饲料中猪、牛、鸡等动物源成分进行定性检测，不能进 行定量检测，无法依据阳性结果判断是因为生产者故意掺假还是生产中污染造成。同时因 为大部分检测标准的目标基因是18S rRNA等多拷贝基因，检测灵敏度非常高（可检出 0.001%特定动物源性成分），容易出现假阳性结果。这些缺点限制使这些检测标准无法作 为判断是否惨假的依据，因此急需一种准确快速的猪肉成分定量检测方法作为肉类惨假判 定的依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于，提供牛肉制品中猪肉成分定量检测方法。
[0006] 本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：
[0007] 牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0008] 步骤一，样品预处理；
[0009] 步骤二，DNA抽取；
[0010] 步骤三，DNA浓度和纯度的测定；
[0011] 步骤四，实时荧光PCR反应；
[0012] 步骤五，结果计算。
[0013] 本发明进行牛肉制品中猪肉成分含量定量检测，检测过程简便，结果准确，并且提 取的猪肉浓度参考物质DNA可以长时间保持，与购买商业试剂盒相比，成本低廉，满足了猪 肉掺假鉴定的需要。
[0014] 所述步骤一中，所述样品为干燥固体时，可直接以粉碎机研磨成细粉;所述样品为 湿状时，经冷冻干燥处理后，再研磨成细粉备用。
[0015] 作为一种方案，所述步骤二中，包括2-1:称取两个0.2g样品试样，至2ml离心管中， 加入900yL预热的CTAB裂解缓冲液和40yL蛋白酶K，轻轻混匀后，65°C水浴保温30min;
[0016] 2-2:12000g离心5min，取上清于另一干净的2ml离心管中，加入等体积的酚，三氯 甲烷和异戊醇的混合液(25:24:1 )，震荡混匀；
[0017] 2-3:12000g离心5min，取上清至干净的2ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷和异 戊醇的混合液(24:1)，颠倒混勾，12000g离心10min，取上清至干净的2ml离心管中；
[0018] 2-4:加入等体积异丙醇，颠倒混勾，12000g离心5min，弃去上清液;E.用4°C预冷的 70 %乙醇500yL，涡旋清洗沉淀，12000g离心5min，弃去上清液；
[0019] 2-5:倒置晒干后加100yL RNA酶A缓冲液，37°C温育30min;
[0020] 2-6:重复步骤2-4、2-5，倒置晒干后加50yL TE缓冲液溶解沉淀，-20°C保存备用。
[0021]作为另一种方案，所述步骤二中，也可使用商品化DNA提取试剂盒提取DNA。
[0022]所述步骤三中，使用紫外分光光度计检测提取的DNA的吸光值A260和A280,其 A260/A280比值应在1.7~2.0之间，按以下公式计算DNA浓度：
[0023] c=A*N*50
[0024] C 一 DNA 浓度，单位为 ng/yL;
[0025] A-260nm处的吸光值
[0026] N-DNA稀释倍数
[0027] 将DNA浓度稀释到50ng/yL。
[0028] 所述步骤四中，还包括扩增，扩增时，应设立两个对照：阴性对照（牛基因组DNA)、 空白对照(不含DNA模板，可以水代替）；每个反应，各浓度参考物质和样品试样需设置三个 重复试验;分别对猪特异性内源基因和动物参照基因进行实时荧光PCR反应;反应体系如 下：
[0029] 2X TaqMan Universal PCR Master Mix.........12.5μ1
[0030] 上游引物 ΙΟμΜ.......................................0·5μ1
[0031] 下游引物 ΙΟμΜ.......................................0·5μ1
[0032] 探针...................................................〇·5μ1
[0033] DNA 模版................................................2μ1
[0034] ddH20 至总体积 25μ1
[0035] 反应管离心后放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
[0036] 预变性:95°C 10min，l 个循环；
[0037] PCR扩增：95°C 15sec;60°C 60sec，40个循环。
[0038] 所述步骤五中，使用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果;空白对照的猪特异 性内源基因和动物参照基因应无扩增曲线；阴性对照、参考物质和样品的动物参照基因应 出现扩增曲线，且Ct值小于30;阴性对照的猪特异性内源基因应无扩增曲线;标准曲线制 作，根据实时荧光PCR分析结果，获得不同浓度参考物质的猪特异性内源基因的Ct值和动物 参照基因的ct值，再求得三个重复试验的ct值平均值，将参考物质的猪特异性内源基因的 ct值平均值减去动物参照基因的Ct值平均值后所得值Act为纵坐标，以参考物质的猪肉成 分含量的对数为横坐标，进行线性回归分析并制作标准曲线：
[0039] ACt=AlgN+B.......................................公式 1
[0040] ACt:猪特异性内源基因的Ct值平均值减去动物参照基因的Ct值平均值。
[0041] N:猪肉成分含量 [0042] A:标准曲线斜率。
[0043] B:标准曲线Y轴之截距。
[0044] (注:如三个重复试验结果出现偏离现象时，应将该偏离数据舍弃，但每个浓度皆 应有代表数据存在。）
[0045] 样品中猪肉成分含量计算，根据实时荧光PCR分析结果，获得样品的的猪特异性内 源基因的Ct值和动物参照基因的Ct值。再求得三个重复试验的Ct值平均值。根据标准曲线 公式1，按以下公式得出样品中猪肉成分含量N( % ):
[0046]
[0047] 计算两个样品试样的猪肉成分含量平均值H。
[0048]本发明中两个样品试样中猪肉成分浓度见和他的相对偏差应小于15%，艮口：
[0049]
[0050] 所述步骤四中，扩增所述猪特异性内源基因（目的基因 cytb)的引物和探针：
[0051 ]上游引物F1:5' -CGACAAAGCAACCCTCACAC-3'
[0052] 上游引物R1:5' -TGCGAGGGCGGTAATGAT-3'
[0053] 探针P1:5' -(FAiO-CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTCHTAMRA)』'，其5 ' 端标记FAM 报告荧光集团，3'端标记TAMRA淬灭荧光基团；
[0054] PCR扩增产物大小70bp。
[0055] 所述步骤四中，扩增所述动物参照基因（目的基因 12S rRNA)的引物和探针：
[0056] 上游引物F2:5' -CAAACTGGGATTAGATACCCCACTA-3'
[0057] 上游引物R2:5' -ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3'
[0058] 探针 PSA' -(FAiO-CACCGCCAAGTCCTTTGRGTTTTARGtXTAMRA)』'，其5'端标记 FAM 报告荧光集团，3'端标记TAMRA淬灭荧光基团;PCR扩增产物大小154~155bp。
[0059] 在应用中，所述步骤四中，扩增所述猪特异性内源基因（目的基因 cytb)的引物和 探针、扩增所述动物参照基因（目的基因 12S rRNA)的引物和探针的浓度为ΙΟμΜ。
【附图说明】
[0060] 图1为本发明的流程示意图。
【具体实施方式】
[0061] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体图示进一步阐述本发明。
[0062] 参照图1，牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，包括以下步骤：
[0063] 步骤一，样品预处理；
[0064] 步骤二，DNA抽取；
[0065] 步骤三，DNA浓度和纯度的测定；
[0066]步骤四，实时荧光PCR反应；
[0067] 步骤五，结果计算。
[0068] 本发明进行牛肉制品中猪肉成分含量定量检测，检测过程简便，结果准确，并且提 取的猪肉浓度参考物质DNA可以长时间保持，与购买商业试剂盒相比，成本低廉，满足了猪 肉掺假鉴定的需要。
[0069] 步骤一中，样品为干燥固体时，可直接以粉碎机研磨成细粉;样品为湿状时，经冷 冻干燥处理后，再研磨成细粉备用。
[0070] 作为一种方案，步骤二中，包括2-1:称取两个0.