一株海洋细菌Pseudoalteromonas sp SC127及其制备的石莼硫酸鼠李聚糖酶的制作方法
【专利说明】_株海洋细菌Pseudoa I teromonas sp SG127及其制备的石辣硫酸鼠李聚糖酶
技术领域
[0001 ] 本发明属于海洋微生物技术领域，具体涉及一株海洋细菌PseudoalteromonasspSC127及其制备的石莼硫酸鼠李聚糖酶。
【背景技术】
[0002]硫酸鼠李聚糖是广泛存在于石莼、浒苔、礁膜等绿藻中的一种高分子量的硫酸杂多糖，主要由鼠李糖及鼠李糖硫酸酯组成，另外还含有葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、糖醛酸等。研究发现它具有多种生理活性，包括抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖血脂、免疫调节、抗氧化活性等功效，是一类具有重要生物活性的非常有药用价值的化合物。但因硫酸鼠李聚糖分子量巨大，分子量分布从几万到百万不等，严重影响了它的吸收效率;同时其具有一定的粘性，也大大阻碍了它作为药物的应用。目前，降解硫酸鼠李聚糖的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法。较之化学降解法和物理降解法，酶解法具有降解特异性、选择性好，反应过程容易控制，易于得到所需分子量范围的低聚糖产品，产物含量高，功能性强等优势，是降解硫酸鼠李聚糖的最佳方法。
[0003]据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，国内外关于硫酸鼠李聚糖酶已有一些报道，产硫酸鼠李聚糖酶的菌种主要来源于交替单胞菌属(Alteromonassp.)、Catenovulum属海洋细菌及一些真菌。酶的分子量是酶重要的性质表征，它代表了不同酶蛋白的分子大小，也是描述酶学性质的重要指标。如CN104560774A公开了一种来源于Catenovulum属的Catenovulumsp.LP214生产浒苔多糖裂解酶制备硫酸鼠李聚糖镶嵌段寡糖，其酶分子量为75.5 kDa；CN 103451119 A公开了一种来源于交替单胞菌属的AlteromonascdwellianaA321菌株生产浒苔多糖降解酶，其酶LI的分子量约为76.4 kDa，酶L2的分子量约为100 kDa左右;CN1189185公开了一种来源于青霉属的产硫酸鼠李聚糖酶菌株(保藏于CNCM保藏号1-1577和1-1578)，该菌所产酶具有降解鼠李半乳糖醛酸聚糖的能力。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供了一株海洋细菌Pseudoalteromonassp SC127及其制备的石药硫酸鼠李聚糖酶，本发明提供的菌株来源于海洋假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，能够生产硫酸鼠李聚糖酶，有效降解硫酸鼠李聚糖生成寡糖，克服了将硫酸鼠李聚糖应用在保健、医药、农业等方面的困难，对新型寡糖的开发、构效关系研究及应用开发都具有重要的现实意义。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现:
本发明提供了一株海洋细菌Pseudoalteromonas sp SC127，该菌株于2015年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0.M 2015422。
[0006]本发明还提供了所述的海洋细菌Pseudoalteromonas sp SC127产生的石药硫酸鼠李聚糖酶，所述石莼硫酸鼠李聚糖酶通过以下制备方法制得: (1)发酵产酶:将所述菌株SC127接种于含有硫酸鼠李聚糖的培养基中，50?250r/min，15?32°C培养20-48 h，获得种子培养液，将种子培养液接种于新鲜的发酵培养基得到发酵菌液；
(2)粗酶制备:将所述发酵菌液冷冻离心，取上清液；向上清液中缓慢加入预冷丙酮，搅拌均匀，静止，冷冻离心，弃上清;沉淀部分加入蒸馏水复溶，使沉淀充分溶解，冷冻离心，去除不溶的杂蛋白，上清部分即为浓缩粗酶液；
(3)酶的纯化:将浓缩粗酶液通过Q-SepharoseFast Flow阴离子交换层析和Sephadex G_75凝胶过滤层析对酶进行分离纯化，最终获得纯化的石药硫酸鼠李聚糖酶。
[0007]所述石莼硫酸鼠李聚糖酶分子量为110.6 kDa ο
[0008]所述步骤(3)中将浓缩粗酶液过滤后上样于Q-Sepharose Fast Flow离子交换柱，洗脱液为含有NaCl的PBS缓冲液，进行梯度洗脱，流速为I mL/min，收集洗脱液，将有活性的蛋白合并，进行下一步纯化。
[0009]离子交换柱纯化后的活性蛋白浓缩后上样于SephadexG-100凝胶柱，洗脱液为PBS缓冲液，收集洗脱液，将有活性的蛋白合并。
[0010]本发明从海泥样品中筛选出一株高产石莼硫酸鼠李聚糖酶的菌株，依据形态学特征和16SrDNA序列分析，初步鉴定其属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，命名为Pseudoalteromonassp.SC1270
[0011]将该菌株接种到含硫酸鼠李聚糖的培养基中，50?250^11^11，15?32°(:培养20-48 h，将发酵液4°C下8000 rpm冷冻离心5 min，即得含硫酸鼠李聚糖酶发酵菌液。向发酵菌液中加入I倍体积的无水乙醇或丙酮，4°C过夜，于4°C下10000 r/min离心，用等体积的蒸馈水将沉淀复溶，得到粗酶液，进一步采用丙酮沉淀、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephadex G_75凝胶过滤层析对酶进行分离纯化，经SDS-PAGE检验，最终收集到的活力组分呈现单一条带，该酶的相对分子质量为110.6 kDa。经查阅资料、检索文献可知，该石莼硫酸鼠李聚糖酶的分子量不同于以往的报道，且为首次发现假交替单胞菌属菌株具有产硫酸鼠李聚糖酶能力。
[0012]本发明提供的具有硫酸鼠李聚糖酶生产能力的细菌，该菌株产酶活力高。I个酶活单位定义为3 5 °C、P H 7.0条件下，每分钟产生I微克还原糖需要的酶量。经测定，Pseudoalteromonas sp.SC127发酵菌液酶活可达到3.5 U/mL，具有在工业生产中的应用价值。
【附图说明】
[0013]
图1 Pseudoalteromonas sp.SC127菌株所产硫酸鼠李聚糖酶的SDS-PAGE电泳结果。左边为标准蛋白分子量，右边为菌株Pseudoalteromonas sp.SC127发酵并经纯化后的电泳纯度的硫酸鼠李聚糖酶蛋白条带，表示数量单位为:kDa。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0015]—、菌株Pseudoalteromonas sp.SC127的筛选对海藻泥样品进行微生物富集、初筛、复筛，获得产酶菌。对产酶菌进行液体培养，从发酵菌液中提取胞外产物，获得硫酸鼠李聚糖酶。
[0016]具体技术方案如下:
1.富集培养:无菌条件下取适量绿藻样品，加入无菌海水捣碎，取样品2.5 mL接入50mL富集培养基(硫酸鼠李聚糖0.3%，蛋白胨0.5%，硝酸钠0.4%，无水硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.15%，陈海水配制，pH自然)进行培养，在25°C，150 rpm的恒温培养摇床培养7天。培养结束后，取上述富集液5 mL接入富集培养基重复富集两次。
[0017]2.初筛:将富集培养液适当稀释后，涂布于选择性培养基(硫酸鼠李聚糖0.3%，硝酸钠0.4%，无水硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.15%，陈海水配制，pH自然)平板上，在24°C培养2天。将平板中所有形态不同的单菌落，进行纯化培养，再接入2216E琼脂斜面培养基，于250C培养至长满斜面，置于4 V冰