筑波链霉菌及其在制备他克莫司中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型微生物及其用途和应用，尤其涉及一种筑波链霉菌及其在制 备他克莫司中的应用。
【背景技术】
[0002] 他克莫司（Tacrolimus)又名FK506,其化学结构属23元大环内酯类抗生素，为一种 强力的新型免疫抑制剂。在分子水平，本品的作用是由细胞质内与之结合的蛋白FKBP12介 导的。FKBP12使得本品进入细胞内，并形成复合物，该复合物竞争性地与钙调素特异性地结 合并抑制钙调素，后者介导T细胞内-钙依赖性抑制性信号传递系统，从而阻止一系列淋巴 因子基因转录。体内外实验证明，他克莫司是一强效的免疫抑制剂，可抑制细胞毒淋巴细胞 的形成，移植排斥反应主要是由后者引起。该药抑制T细胞活化及TH细胞依赖性的B细胞增 殖，以及淋巴因子的生成如白细胞介素2，白细胞介素3及β-干扰素，以及白细胞介素-2受体 的表达。他克莫司可抑制皮肤、心脏、肾、肝移植的排斥反应，延长同种移植物的存活时间， 已在啮齿类动物、犬、灵长类动物和人类身上得到证实。上市以来已广泛用于肝、肾和骨髓 移植的急慢性排斥治疗。
[0003] 目前有关他克莫司生产方法的报道主要有美国专利US4894366，US4929611， US5116756，US5264355，US5496727和US5624842。这些专利报道了用不同的链霉菌株生产他 克莫司，产量不是很高，US5116756专利中提到的str印tomycessp.MA6858和US5624842中提 到的streptomyces tsukubaensis的他克莫司生产菌株，生产他克莫司的产量都很低，其发 酵液中他克莫司的浓度最高只有37.8mg/L。中国专利《发酵生产他克莫司的方法》 (CN201310644714.1)报道一种链霉菌产他克莫司为385μg/ml，且需中间补料，工艺繁琐。中 国专利《一种链霉菌及其应用》(CN200810019003.4)公开的最高发酵单位为550μg/ml。中国 专利《一种高纯度他克莫司的制备方法》(CN 201210447477.5)公开的最高发酵单位为491μ g /m 1，但未提及发酵工艺。中国专利《基因工程菌筑波链霉菌L 2 0及其应用》 (CN201510664086 · 2)提到基因工程菌通过摇瓶发酵单位可达到716mg/L。
[0004] 国外期刊《Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology》（2009,36 (12):1467-1471)一文《Strain development of Streptomyces sp.for tacrolimus production using sequential adaptation》中提到通过逐渐提高培养基中他克莫司的浓 度600-1600μg/ml来增加菌株对产物的耐受性，最终获得的菌株在5L发酵罐中达到972yg/ ml。国内期刊《微生物学杂志》2014年10月第34卷第5期中的《抗性突变他克莫司高产菌株的 选育》提到通过抗性突变育种得到高产菌株H-493,在50L发酵罐中能达到918μg/ml，但未经 过工业化试生产。这两种菌株都涉及抗性突变选育，其菌种后期的稳定性有待考察。
[0005] 综上所述，国内外报道的他克莫司发酵生产技术中，采用抗性突变菌株、基因工程 菌的发酵技术单位高，但该发酵技术只经过小试试验未经过工业化生产确认;采用常规菌 株的发酵工艺单位低，并且发酵副产物较多，特别是其中的同分异构体FK520的含量较高， 因为是同分异构很难通过后期的纯化工艺去除，导致后提取工艺较为复杂，大大地增加了 后续的提纯难度，难以获得高纯度的最终产品，从而难以更好地进行产业化生产。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对上述问题，提供一种发酵单位高且副产物少的他克莫司产生 菌。
[0007] 本发明所提供筑波链霉菌HDW68,分类命名为streptomyces tsukubansis HDW68， 由中国典型培养物保藏中心保藏（简称CCTCC)，保藏号为:CCTCC M2016086，保藏日期为： 2016年03月07日。所述的保藏号为CCTCC Μ 2016086的菌株是从云南新平哀牢山周围的土 壤中筛选得到的。
[0008] 所述的保藏号为CCTCC Μ 2016086的菌株的菌落特征：菌落橘红色或红色，近圆 形，菌落直径2-4mm，菌落隆起且分瓣，中心陷落成坑。
[0009] 根据微生物形态学及国外相关资料的描述，结合保藏号为CCTCC Μ 2016086的菌 株的各种培养特征和形态特征，该保藏号为CCTCC Μ 2016086的菌株应属于链霉菌属，定名 为streptomyces tsukubansis HDW68〇
[0010] 本发明的另一目的是提供该菌株在制备他克莫司中的应用。
[0011] 所述的保藏号为CCTCC Μ 2016086的菌株可应用于发酵制备他克莫司。该制备方 法包括下列步骤：
[0012] a.发酵菌株采用保藏编号为CCTCC Μ 2016086的菌株；
[0013] b.菌株培养:将按常规方法制备的30%甘油菌丝冷冻管（即工作菌种库）接入摇 瓶进行种子培养得摇瓶种子液;将摇瓶种子液接种于摇瓶发酵培养基中或种子罐中培养； 将种子罐培养液接种于发酵罐培养基培养，收集发酵液;优选在发酵培养过程中无需进行 补料，待种子罐菌丝生长良好接入发酵罐后，根据发酵液实际情况从PH、菌浓、搅拌转速、溶 氧及菌丝镜检情况等方面来控制发酵过程即可。
[0014] c.发酵产物提取:提取、浓缩、预结晶、层析、结晶和干燥。
[0015] 其中所述的步骤b为:将按常规方法制备的30%甘油菌丝冷冻管(工作菌种库）按 摇瓶种子培养基体积的0.8~1.2 %接入摇瓶种子培养基，250rpm，培养22~30h，得摇瓶种 子液;将摇瓶种子液按种子罐培养基体积的〇. 02~0.05 %的接种量接种于种子罐，搅拌速 度150~250rpm，培养22~30h;将种子罐培养液按发酵培养基体积的5~15 %的量接种于发 酵罐培养基，搅拌速度150~250rpm，发酵培养6~7天，收集发酵液;其中培养温度均为26~ 3(TC〇
[0016] 本发明还公开了培养基:按重量体积比计，摇瓶、种子罐培养过程中的碳源为0.5 ~4.0%，优选0.5~3.0%，最优选为1.2~2.5%;氮源为0.2~4.0%，优选0.5~3.5%，最 优选为0.5~2.0%;无机盐为0.2~2.0%，优选0.2~1.5%，最优选0.2~1.0%;其余为水。
[0017] 其中碳源选自可溶性淀粉，大豆油，葡萄糖、玉米淀粉、甘油、麦芽糖、蔗糖中的一 种或几种;优选可溶性淀粉，大豆油，葡萄糖、玉米淀粉、甘油、麦芽糖中的一种或几种;最优 选葡萄糖、玉米淀粉、甘油中的一种或几种。
[0018] 其中氮源选酵母浸出粉、玉米粉、热黄豆饼粉、大豆蛋白粉、豆柏粉、生豆粉、啤酒 酵母粉、固体玉米浆、硫酸铵中的一种或几种;优选热黄豆饼粉、大豆蛋白粉、生豆粉、啤酒 酵母粉、固体玉米浆、硫酸铵中的一种或几种;更优选热黄豆饼粉、啤酒酵母粉、硫酸铵中的 一种或几种。
[0019]其中无机盐Ca⑶3、K2HP〇4、NaCl、KN〇3，MgS〇4、KCl、KH 2P〇4中的一种或几种；优选 CaC03、K2HP04、NaCl、KN〇3、KH2P〇4 中的一种或几种；更优选 CaC03、K2HPO4、KH2P〇4 中的一种或 几种。
[0020]按重量体积比计，发酵培养过程中的碳源为3.0~12.0 %，优选3.0~10.0) %，最 优选7.0~9.0%;氮源为1.0~8.0%，优选1.0~6.0%，最优选2.9~4.5%;无机盐为0.2~ 2.0%，优选0.2~1.5%，最优选0.25~1.0%;氨基酸为0.2~2.0%，优选0.2~1.5%，最优 选0.5~1.0%;其余为水。
[0021]其中碳源选自可溶性淀粉、玉米淀粉、甘油、葵花籽油、糊精、葡萄糖、土豆淀粉、 麦芽糖、蔗糖、菜油、甘露醇中的一种或几种;优选可溶性淀粉、玉米淀粉、甘油、葵花籽油、 糊精、葡萄糖、土豆淀粉、麦芽糖、菜油、甘露醇中的一种或几种，最优选玉米淀粉、甘油、糊 精、葡萄糖中的一种或几种。
[0022]其中氮源选自豆柏粉、生豆粉、肉胨、啤酒酵母粉、面包酵母粉、热黄豆饼粉、固体 玉米浆、硫酸铵、鱼胨、酵母浸出膏、尿素、棉籽饼粉、酵母浸出粉、蚕蛹粉、玉米蛋白粉中的 一种或几种;优选豆柏粉、生豆粉、肉胨、啤酒酵母粉、面包酵母粉、热黄豆饼粉、固体玉米 浆、硫酸铵、酵母浸出膏、尿素、玉米蛋白粉中一种或几种;更优选为啤酒酵母粉、面包酵母 粉、热黄豆饼粉、固体玉米浆、硫酸铵、肉胨中一种或几种。
[0023]其中无机盐选自 CaC03、MgS〇4、K2HP〇4、NaCl、KN〇3，ZnS〇4、KC1、KH 2P〇4 中的一种或几 种；优选〇3〇)3、]\%3〇4、1(2冊〇4、恥(：1、謂03、101屮〇4中的一种或几种 ；最优选〇3〇)3、1(2册〇4、似(：1 中的一种或几种。
[0024]其中氨基酸选自亮氨酸，L-异亮氨酸、L-缬氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠、L-组氨酸中一 种或几种;优选为自亮氨酸，L-异亮氨酸、L-缬氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠中一种或几种;最优 选为L-异亮氨酸、谷氨酸钠中一种或几种。
[0025]经发酵完成放罐后，对发酵产物进行提取、浓缩、预结晶、层析、结晶和干燥后可以 获得纯度达99%以上的他克莫司。
[0026]本发明的技术效果主要体现在：
[0027] 1、本发明所公开的筑波链霉菌是目前用于生产的一种高单位的他克莫司产生菌， 发酵性能优良，可用于大规模生产。本发明提供的发酵工艺经过摇瓶、小试(1吨发酵罐）、中 试(4吨发酵罐)及20吨生产发酵罐进行试验及生产，其生产能力稳定。经检测，用本发明提 供的菌株及发酵培养方法制备的他克莫司效价达到ll〇〇μg/ml或以上，从而为后续的工业 化生产提供了良好的基础。
[0028] 2、本发明所公开的菌株从云南新平哀牢山周围的土壤中筛选得到的，在优化工艺 后，经多年实验及生产，其菌株稳定性良好。经生理生化、培养特征及基因测序证明该菌株 为筑波链霉菌。
[0029] 3、本发明所公开的筑波链霉菌的发酵副产物相对较少，特别是他克莫司的重要副 产物也是同分异构体FK520的含量明显减少，降低了后提取的难度，提取和纯化的工艺相对 简单，大大提高了收率和纯度，在工业化生产上更具优势。
[0030] 菌株保藏情况:保藏于中国典型培养物保藏中