g，啤酒酵母粉3kg，硫酸铵4.5kg，K2HP〇4 7.5kg， CaC03 7 · 5kg，泡敌1 · 5kg，pH自然，定容至1 · 5吨。
[0114] 装量:4吨发酵罐内装培养基1.5吨，121°C灭菌30min。
[0115] 接种量:600ml摇瓶种子。
[0116] 培养：28°C，28h，250rpm
[0117] 3.发酵罐培养
[0118] 培养基:甘油140kg，葡萄糖280kg，玉米淀粉210kg，肉胨70kg，啤酒酵母粉105kg， 热黄豆粉35kg，固体玉米浆70Kg，硫酸铵35kg，L-异亮氨酸35Kg，谷氨酸钠35kg，K2HP〇4 21kg，NaCl 28kg，CaC03 21kg，泡敌 14kg，加水定容至7吨，调ρΗ9·5。
[0119] 装量:20吨发酵罐内装培养基7吨 [0120] 接种量:0.35吨的种子液
[0121] 培养温度:30 °C，起始调节罐压0.05MPa，空气流量在1: (0.6 ± 0.2) vvm，搅拌转速 150rpm。代谢过程中当相对溶氧值低于30 %时，先调大空气流量到1: (1 ± 0.2) vvm;当相对 溶氧值再次低于30 %时，调大搅拌桨变频值(搅拌桨变频值在（150~250 )rpm之间）；如果相 对溶氧值再次低于30%，则在(0.05~0.08)MPa范围内增大罐压(发酵过程中罐压维持在 (0.02~0.08)之间）。发酵周期为7天。
[0122] 发酵液放罐单位:1184μg/ml。
[0123] 实例7:他克莫司的生产发酵培养
[0124] 采用CCTCC Μ 2016086的菌株
[0125] 1.摇瓶种子培养
[0126] 培养基:葡萄糖lg，玉米淀粉5g，热黄豆饼粉10g，CaC03 7.5g，pH自然，加水定容至 500ml，分装5瓶。
[0127]接种量:按1 .〇mi/瓶的接种量
[0128] 培养：28°C，26h，250rpm
[0129] 在菌丝长起，有明显挂壁现象后，将500ml摇瓶种子培养液接入种子罐中培养。
[0130] 2.种子罐培养
[ΟΙ31 ]培养基:葡萄糖3kg，玉米淀粉15kg，热黄豆饼粉30kg，CaC〇3 3kg，泡敌1.5kg，pH自 然，定容至1.5吨。
[0132] 装量:4吨发酵罐内装培养基1.5吨，121°C灭菌30min。
[0133] 接种量:500ml摇瓶种子。
[0134] 培养：28°C，25h，200rpm
[0135] 3.发酵罐培养
[0136] 培养基:糊精910kg，面包酵母粉78kg，啤酒酵母粉221kg，固体玉米浆65Kg，硫酸铵 13kg，CaC03 32.5kg，CaC03 6.5kg，泡敌42kg，加水定容至 13吨，调ρΗ8·9。
[0137] 装量:20吨发酵罐内装培养基13吨 [0138]接种量:1.5吨的种子液
[0139] 培养温度：26°C，起始调节罐压0.05MPa，空气流量在1: (0.6 ± 0.2) vvm，搅拌转速 150rpm。代谢过程中当相对溶氧值低于30 %时，先调大空气流量到1: (1 ± 0.2) vvm;当相对 溶氧值再次低于30%时，调大搅拌桨变频值(搅拌桨变频值在（150~250)rpm之间）；如果相 对溶氧值再次低于30%，则在(0.05~0.08)MPa范围内增大罐压(发酵过程中罐压维持在 (0.02~0.08)之间）。发酵周期为6.5天。
[0140]按照上述发酵条件和工艺，在20吨发酵罐进行3批发酵试验，发酵单位分别为1158 μg/ml、1161μg/ml和1216μg/ml。
[0141] 实施例8:FK520含量测定
[0142] 测定方法:HPLC法检测
[0143] 样品:实施例7中的发酵液
[0144] 对照样:按中国专利《一种链霉菌及其应用》(CN200810019003.4)实施例6制备的 样品。
[0145] 色谱条件：
[0146] 色谱柱:C8柱(4.6X150mm，5ym);
[0147] 流速：1 .OmL/min;
[0148] 进样体积:20μ1;
[0149] 检测波长：210nm;
[0150] 柱温:60 °C;
[0151 ] 记录时间：65min(其中样品的间隔时间不得少于lmin);
[0152] 流动相:溶液A和溶液B的混合液，梯度时间程序表见下表。
[0153]
[0154] 溶液A:0.02mol/L磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH至3.5。
[0155] 溶液B:乙腈。
[0156] 空白：丙酮。
[0157] 结果：
[0158] 经HPLC检测后，以按中国专利《一种链霉菌及其应用》(CN200810019003.4)实施例 6制备的样品中FK520含量为3.58 %，见附图1。以实施例7制备得到的样品的FK520含量为分 别1.47%、1.55%、1.61%，见附图2、3、4。两者相比^1(520含量下降50%。
【主权项】
1. 一种筑波链霉菌（streptomyces tsukubansis)HDW68，由中国典型培养物保藏中心 保藏，保藏号为CCTCC Μ 2016086,保藏日期为:2016年03月07日。2. 如权利要求1所述的保藏号为CCTCC Μ 2016086的菌株在发酵制备他克莫司中的应 用。3. 应用权利要求1所述的保藏号为CCTCC Μ 2016086的菌株发酵制备他克莫司的方法， 其特征在于包括下列步骤： a. 发酵菌株采用保藏编号为CCTCC Μ 2016086的菌株； b. 将CCTCC Μ 2016086的菌株接入摇瓶种子培养基，250rpm，培养22~30h，得摇瓶种子 液； 将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.02~0.05 %的接种量接种于种子罐，搅拌速度 150 ~250rpm，培养 22 ~30h; 将种子罐培养液按发酵培养基体积5~15%的量接种于发酵罐培养基，搅拌速度150~ 250rpm，发酵培养6~7天，收集发酵液； 其中培养温度均为26~30 °C。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤b中摇瓶、种子罐培养过程中按重量 体积比计，碳源为0.5~4.0 %，优选0.5~3.0 %，最优选为1.2~2.5 % ;氮源为0.2~4.0 %， 优选0.5~3.5%，最优选为0.5~2.0%;无机盐为0.2~2.0%，优选0.2~1.5%，最优选0.2 ~1.0% ;其余为水。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤b中发酵培养过程中培养基按重量体 积比计，碳源为3.0~12.0%，优选3.0~10.0%，最优选7.0~9.0%;氮源为1.0~8.0%，优 选1.0~6.0%，最优选2.9~4.5% ;无机盐为0.2~2.0%，优选0.2~1.5%，最优选0.25~ 1.0%;氨基酸为0.2~2.0%，优选0.2~1.5%，最优选0.5~1.0%;其余为水。6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于 所述碳源选自可溶性淀粉，大豆油，葡萄糖、玉米淀粉、甘油、麦芽糖、蔗糖中的一种或 几种;优选可溶性淀粉，大豆油，葡萄糖、玉米淀粉、甘油、麦芽糖中的一种或几种;最优选葡 萄糖、玉米淀粉、甘油中的一种或几种； 所述氮源选酵母浸出粉、玉米粉、热黄豆饼粉、大豆蛋白粉、豆柏粉、生豆粉、啤酒酵母 粉、固体玉米浆、硫酸铵中的一种或几种;优选热黄豆饼粉、大豆蛋白粉、生豆粉、啤酒酵母 粉、固体玉米浆、硫酸铵中的一种或几种;更优选热黄豆饼粉、啤酒酵母粉、硫酸铵中的一种 或几种； 所述无机盐Ca⑶3、K2HP〇4、NaCl、KN〇3，MgS〇4、KCl、KH2P〇4中的一种或几种；优选Ca⑶ 3、 1(2册〇4、恥(：1、謂03、1012?〇4中的一种或几种；更优选〇3〇) 3、1(2册〇4、1(!12?〇4中的一种或几种。7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于 所述碳源选自可溶性淀粉、玉米淀粉、甘油、葵花籽油、糊精、葡萄糖、土豆淀粉、麦芽 糖、蔗糖、菜油、甘露醇中的一种或几种;优选可溶性淀粉、玉米淀粉、甘油、葵花籽油、糊精、 葡萄糖、土豆淀粉、麦芽糖、菜油、甘露醇中的一种或几种，最优选玉米淀粉、甘油、糊精、葡 萄糖中的一种或几种。8. 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述氮源选自豆柏粉、生豆粉、肉胨、啤酒酵母 粉、面包酵母粉、热黄豆饼粉、固体玉米浆、硫酸铵、鱼胨、酵母浸出膏、尿素、棉籽饼粉、酵母 浸出粉、蚕蛹粉、玉米蛋白粉中的一种或几种;优选豆柏粉、生豆粉、肉胨、啤酒酵母粉、面包 酵母粉、热黄豆饼粉、固体玉米浆、硫酸铵、酵母浸出膏、尿素、玉米蛋白粉中一种或几种;更 优选为啤酒酵母粉、面包酵母粉、热黄豆饼粉、固体玉米浆、硫酸铵、肉胨中一种或几种。9. 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述无机盐选自Ca⑶3、MgS〇4、K2HP〇4、NaCl、 〇3,21^〇4、1((：1、1012?〇4中的一种或几种；优选〇3〇)3、]\%5〇4、1(2册〇4、似(：1、咖〇3、1012?〇4中的 一种或几种;最优选CaC〇3、K2HP〇4、NaCl中的一种或几种。10. 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述氨基酸选自亮氨酸，L-异亮氨酸、L-缬氨 酸、谷氨酸、谷氨酸钠、L-组氨酸中一种或几种;优选为自亮氨酸，L-异亮氨酸、L-缬氨酸、谷 氨酸、谷氨酸钠中一种或几种;最优选为L-异亮氨酸、谷氨酸钠中一种或几种。
【专利摘要】本发明公开了一种筑波链霉菌(streptomyces？tsukubaensis)HDW68及其应用，该菌种由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC？M？2016086，保藏日期为：2016年03月07日。本发明还公开了一种由此菌株发酵制备他克莫司中间体的方法。本发明提供的发酵工艺经1吨、4吨、20吨发酵罐的生产实践，证明其生产能力稳定，发酵单位高且发酵副产物(FK520)相对较少，大大地降低了后提取的难度，适宜工业化大生产且获得的他克莫司产品质量高。CCTCC M 201608620160307
【IPC分类】C12R1/465, C12N1/20, C12P17/18
【公开号】CN105624068
【申请号】CN201610135737
【发明人】吴萍, 杨永梅, 颜仁江, 方一民, 张薇
【申请人】杭州中美华东制药有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月10日