一株海洋柴油降解菌bhb-16及其固定化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体为筛选出一株可高效降解海洋柴油的菌株BHB-16,开发了一种可有效固定该菌株的方法并初步检测了该固定化方法对石油降解率的影 响。
【背景技术】
[0002] 近年来，柴油已成为海洋的主要污染物质之一，主要通过沿海工业排放、海上油 井、输油管道及船舶泄漏等多种途径进入海洋，而此类情况不仅会严重影响所污染地区的 生态环境，同时也间接阻碍了中国沿海地区的经济发展。目前，针对柴油污染，尤其是大面 积柴油泄漏，通常采用物理法、化学法以及生物修复的方法予以处理。一些物理方法如人工 打捞等往往适用于突发性溢油的回收并控制溢油的扩散，但是处理效率受天气、海洋状况 以及溢油类型影响;而如柴油乳化等化学方法，虽可以暂时清洁海面，但极易促使大量的原 油沉降海底，引起海底荒漠化，进而诱发二次污染。
[0003] 生物修复技术具有成本低、操作简便、处理效果好等优点，因而现今被公认为最有 前景的海洋污染治理方法。由于自然环境的复杂性，使得直接投加外源高效降解菌在自然 环境下的柴油污染修复中往往难以达到预期效果，这促使污染海洋的生物修复日渐转向于 依赖海洋微生物的降解作用，尤其是已经适应海底环境的各种土著柴油降解微生物，它们 不仅可以克服海洋中各种极端条件，还可以以柴油为食，有效的对柴油进行分解转化，从而 改变海洋生态环境。然而，由于许多微生物在水中通常以悬浮状态生长，菌体极易流失，这 使得降解菌的浓度偏低，对柴油等污染物无法达到明显的降解效果。
[0004] 微生物固定化技术是从20世纪60年代开始迅速发展起来的一项新技术，主要通过 利用物理或化学的方法将微生物定位于限定的空间区域，具有微生物密度高、反应迅速、微 生物流失少等优点，将其应用于柴油污染的生物治理有着极大的应用潜力和发展前景。
【发明内容】
[0005] 本研究筛选出一株可高效降解海洋柴油的菌株BHB-16,并以珊瑚石作为固定化载 体，系统研究了该固定化材料对微生物的固定化效果以及固定化前后柴油降解菌株BHB-16 对柴油的降解效率。
[0006] 本发明获得一株可高效降解柴油的细菌，该菌株为BHB-16(Lutibacterium)，其在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 11549。
[0007] 本发明还公开一种对上文所述的细菌BHB-16的固定化方法，其步骤包括：
[0008] ①活化菌种 BHB-16，菌浓度达 0D600nm= 1 · 182~1 · 188;
[0009] ②将珊瑚石载体进行清洗、煮沸和烘干后，利用排水法准确称量其体积；
[0010] ③向步骤②所得珊瑚石载体中加入2216E液体培养基，灭菌后，再加入步骤①所得 细菌BHB-16，所加珊瑚石载体颗粒、2216E液体培养基以及菌液的体积比例为（10~14)mL: 60mL: (0.4~0.5)mL;于28~30°C、80~120rpm/min摇床中培养28~30h后，完成珊糊石载体 对细菌BHB-16的固定化。其中，载体颗粒、2216E液体培养基以及菌液的体积比例为12mL: 60mL: 0.4mL，培养温度为28 °C，摇床转速为80rpm/min，培养时间为28h时，珊瑚石载体对细 菌BHB-16菌液的固定化效果最佳。
[0011]上文所述的对细菌BHB-16的固定化方法中，步骤①所述活化菌种BHB-16过程中使 用的培养基为2216E液体培养基;培养条件为28~30°C、150~180rpm/min，当培养温度为28 °C，摇床转速为150rpm/min时，菌体长势最好，菌浓度最高为0D600nm=l. 188。
[0012] 本发明上文所述的可高效降解柴油的细菌BHB-16在海洋柴油降解中有广泛的应 用前景。
[0013] 本发明具有如下优点：
[0014] 1、本发明所述方法获得的固定化BHB-16菌的操作简单，且珊瑚石载体颗粒对微生 物无任何毒副污染，珊瑚石载体颗粒可以作为安全有效的吸附载体。
[0015] 2、本发明所述的固定化BHB-16菌的方法所使用的原材料价格低廉，当珊瑚石载体 颗粒完成对菌株BHB-16的固定化后，通过高温灭菌、清洗处理和煮沸，进而达到对固定化载 体的回收利用，有助于资源的节约和环境的保护。
[0016] 3、通过本发明实施例的数据表明，本发明所述的BHB-16游离菌对柴油的降解率为 52.2%，而通过本发明所述方法制得的固定化颗粒，具有很好的微生物活性，对柴油具有很 好降解性能，降解率最高可达82.2%，相对于游离菌而言有效提高了30%。
【附图说明】
[0017] 图1为菌体的接种量对载体固定化效果的影响。其中，横坐标为菌体的接种量 (mL)，纵坐标为载体对菌液的吸附量(mL)。向含有12mL载体的60mL 2216E液体培养基中，分 别接种0.4、0.5、0.6、0.7和0.811^处于稳定生长期的柴油降解菌冊8-16(0060011111=1.182~ 1.188)，检测不同接种量对载体固定化效果的影响。结果如图1所示，载体对菌株的固定化 效果随接种量的增大呈下降的趋势，当接种量为〇. 4~0.5mL时，载体对BHB-16菌液的吸附 量相对较多，于〇.4mL时达到最大，即具有最优固定化效果。由此确定固定化过程中菌株的 接种量与培养基的体积比在(〇.4~0.5)mL:60mL范围内，均可以达到较好的固定化效果，当 二者比例为0.4mL: 60mL时，固定化效果最佳。
[0018] 图2为菌株的培养时间对载体固定化效果的影响。其中，横坐标为菌体对载体的吸 附时间(h)，纵坐标为载体对菌液的吸附量(mL)。向含载体量为12mL的60mL 2216E液体培养 基中接入〇.4mL处于稳定生长期的石油降解菌BHB_16(0D600nm=l. 182~1.188)，于不同温 度下连续培养，并分别于培养后的24、26、28、30和32h时测定固定化载体对菌株的吸附量， 进而判断其固定化效果。实验结果如图2所示，珊瑚石对菌株的固定化效率随时间的延长呈 现增高后降低的趋势，当培养时间为28~30h时载体对菌株的吸附效果较好，在28h时，其吸 附量达到最高。由此确定固定化过程中菌株最适的培养时间为28~30h，并且于28h时固定 化效果最佳。
[0019] 图3为载体投加量对其固定化效果的影响。其中，横坐标为载体投加量(mL)，纵坐 标为载体对菌液的吸附量(mL)。由图3可见，珊瑚石载体对于菌株的固定化效率随载体量增 加均呈现先增高后降低的变化趋势。当载体投加量为10~14mL时，载体对菌株的吸附量较 大，于12mL时，吸附量达到最高水平，载体固定化效果最好。由此确定，固定化过程中载体的 投加量与培养基的体积比在10~14mL:60mL范围内，均可以达到较好的固定化效果，当二者 比例为12mL:60mL时，固定化效果最佳。
[0020] 图4为固定化菌对柴油的降解效率。其中，横坐标为游离菌及固定化菌，纵坐标为 二者对柴油的降解效率（％ )。如图4所示，使用珊瑚石作为载体的实验组中，游离菌对柴油 的降解率为52.2%，而固定化菌对柴油的降解率为82.2%，有效提高了30%。由此可见，当 菌株被载体固定化后，可有效提尚其对石油的降解效率。
【具体实施方式】
[0021] 下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。
[0022] Premix ExTaq Version2.0:购自于宝生物工程(大连)有限公司；引物:合成自上 海生物工程有限公司；2216E琼脂及液体培养基:购自于青岛高科园海博生物技术有限公 司；柴油：市售〇号柴油；珊瑚石；购自于大连汇新钛设备开发有限公司，颗粒大小为〇 . 8-1.0cm〇
[0023] 本发明所述的可高效降解柴油的细菌为BHB-16,该菌已于2015年10月28日保藏于 中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No. 11549,保藏中心地址为:北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。