[0024] 实施例1
[0025] 1降解菌BHB-16的筛选
[0026] 取10g沿海沉积物样品（取自辽东湾海域斑海豹自然保护区），溶于含0.2% (v: v) 柴油的100mL灭菌的海水中，28°C、150rpm/min摇床培养20天，每隔10天需补加柴油一次，柴 油加入量同样为0.2% (v:v)。将上述经柴油处理后的沉积物以10倍浓度作梯度稀释后，均 匀涂布于含0.2%(v:v)柴油的2216E固体培养基上，28°C恒温培养2天后，挑取单菌落，在 2216E固体培养基中划线纯化。该菌株的菌落呈橘黄色，形态呈圆形，表面光滑透明，菌落边 缘齐整。
[0027] 2降解菌BHB-16的扩大培养
[0028] 挑取纯化后的BHB-16单菌落转接入2216E液体培养基中，并于28°C、150rpm/min的 恒温摇床中进行扩大培养，培养时间为24h，此时菌体进入稳定期生长期，菌浓度达到最大 (0D600nm= 1.188)〇
[0029] 3降解菌BHB-16的初步鉴定
[0030] 提取柴油降解菌BHB-16的基因组DNA，利用16S rDNA通用引物SEQ ID N0.1(27F: 5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '）和SEQ ID NO · 2(1492R: 5 '-GTTACCTTGTTACGACTT-3 '）对该 菌株的16S rDNA基因保守区域的核苷酸序列进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50yL，包 括25yL Premix ExTaq Version2.0(购自宝生物工程(大连)有限公司），2yL DNA模板，正反 向引物各ΙμLΧ 10μΜ)(合成自上海生物工程有限公司），最后加水将总体系补至50yL。
[0031] PCR扩增条件为：95Γ预变性511^11;95。(：、3〇8,57。(：、4〇8,72。(：、1.511^11 ;72。(：延伸 8min，共35个循环，PCR扩增产物应用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0032]将16S rDNA扩增产物送至上海生物工程有限公司进行测序，结果表明：该菌株的 16S rDNA基因保守区域的核苷酸序列全长为1327bp，应用BLAST与NCBI-nr数据库进行比 对，结果表明：该菌与Lutibacterium菌序列相似度高达99%，因而初步判断该菌株属于 Lutibacterium菌属，将其命名为BHB-16。测序结果如SEQ ID N0.3。
[0033] 实施例2
[0034] 1.固定化载体的预处理
[0035]将珊瑚石载体用清水冲洗数次，直至将其上附着的悬浮颗粒物清洗干净，经煮沸 后于自然环境风干。利用排水法测定单位质量载体的体积。
[0036] 2.柴油降解菌固定化条件的优化
[0037]将预处理后的固定化载体加入至60mL 2216E液体培养基中，于121°C下灭菌 20min，接种处于稳定生长期的柴油降解菌株BHB-16(0D600 = 1.188)，分别考察菌体接种 量、培养时间和载体投加量对于菌体固定化的影响。结果表明：固定化过程中，菌体接种量 与培养基体积的最优比为0.4mL: 60mL;菌体最佳培养时间为28h;载体添加量与培养基体积 的最优比为12mL: 60mL;在此条件下，珊瑚石对BHB-16菌液的吸附量可达到最大，固定化效 果最优。
[0038] 3.柴油降解率的测定
[0039]以柴油浓度为300mg/L的灭菌海水为培养基，接种固定化条件最佳的菌株，于28 °C、80rpm/min恒温摇床中振荡培养7天。以同样条件培养的游离菌作为阳性对照，以不接种 任何降解菌作为阴性对照，每个样品设置3个平行。柴油降解率的测定采用紫外分光光度 法，λ = 225ηπι。结果表明：使用珊瑚石作为载体的实验组中，游离菌对柴油的降解率为 52.2 %，而固定化菌对柴油的降解率为82.2 %，有效提高了30%。由此可见，当菌株被珊瑚 石载体固定化后，可有效提高其对石油的降解效率。
[0040] 实施例3
[0041 ]固定化载体的生物安全性评价
[0042]挑选长势健康且有活力、均重为13±0.19g的刺参200头，实验前暂养7天。暂养和 实验期间水温为15 ± 1°C，盐度为30 ±0 · 5，pH为8 · 0±0 · 1，溶氧为6 · 5±0 · 5mg/L。试验水桶 容积为40L，预先需用lOppm高锰酸钾消毒3天，之后反复用水清洗干净后，放入实验刺参。
[0043] 实验分为2组，实验组需向刺参养殖水体中投加固定化菌群，投加量为水量的10 % (V:V)，对照组的刺参养殖水体中则不投加固定化菌群。每组随机挑选30头刺参进行实验， 且该实验需生物学重复3次。每天于早8:00，下午4:00各投饵1次，每次投喂量为刺参体重的 2% ;每日早7:00需换水一次，换水量为总水量的1/3(v: v);每两天吸底一次，每隔15天清洗 实验桶1次，实验期间需保持连续通气，整个实验周期为15天，期间观察并记录刺参生理状 况和死亡数。
[0044] 表1固定化载体生物安全性评价结果。
[0045]
[0046] 结果表明：在固定化菌群投入后，实验组和对照组相比，刺参的死亡率没有显著区 另IJ，它们在实验初期均可以正常摄食、活动规律，并且没有出现肿嘴、摇头、吐肠、化皮等不 良生理反应，只是在实验后期才出现个别死亡现象。当培养15天后，添加固定化菌群的实验 组刺参死亡率为5.6%，而空白对照组为3.3%，二者并没有明显差异，说明实验所用固定化 菌群在10 %投加量的范围内对于刺参是安全的。
【主权项】
1. 一株可高效降解柴油的细菌，其特征在于，该菌株为冊13-16(1^11:;^3(^61'；[11111)，其在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 11549。2. 如权利要求1所述的细菌BHB-16的固定化方法，其特征在于，步骤包括： ① 活化菌种MB-16,菌浓度达0D600nm=l. 182~1.188; ② 将珊瑚石载体进行清洗、煮沸和烘干后，利用排水法称量其体积； ③ 向步骤②所得珊瑚石载体中加入2216E液体培养基，灭菌后，再加入步骤①所得细菌 BHB-16菌液，所加载体颗粒、2216E液体培养基以及细菌BHB-16菌液的体积比例为（10~14) mL: 60mL: (0 · 4~0 · 5)mL;于28~30°C、80~120rpm/min摇床中培养28~30h后，完成珊糊石 载体对细菌BHB-16的固定化。3. 根据权利要求2所述的固定化方法，其特征在于:步骤①活化菌种BHB-16过程中使用 的培养条件为28~30°C、150~180rpm/min。4. 如权利要求1所述的可高效降解柴油的细菌BHB-16在海洋柴油降解中的应用。
【专利摘要】本发明筛选出一株可高效降解海洋柴油的菌株BHB-16，开发了一种可有效固定该菌株的方法并初步检测了该固定化方法对石油降解率的影响。所述可高效降解柴油的细菌为BHB-16，保藏编号为CGMCC？No.11549，筛选自经柴油处理后的沿海沉积物中，该菌可在含0.2％(v:v)柴油的2216E固体培养基中正常生长，通过分析其16s？DNA基因保守区域的核苷酸序列发现，该菌株为Lutibacterium菌属。以珊瑚石为吸附载体，该菌体可吸附在载体颗粒内外表面，形成柴油降解菌BHB-16与珊瑚石颗粒高度、紧密结合的产物，进而实现了珊瑚石载体颗粒对BHB-16的固定作用。上述菌株及其固定化方法可应用于海洋柴油降解过程中。CGMCC No.1154920151028
【IPC分类】C12N11/14, C02F101/32, C02F3/34, C12N1/20, C12R1/01
【公开号】CN105624058
【申请号】CN201510885451
【发明人】关晓燕, 董颖, 杨爱馥, 陈仲, 王摆, 王召会, 蒋经伟, 高杉, 姜冰, 苏鹤声, 孙红娟, 姜北, 周遵春
【申请人】辽宁省海洋水产科学研究院
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2015年12月4日