筑波链霉菌及其在制备他克莫司中的应用_2

文档序号:9859018阅读:来源:国知局
心(简称CCTCC),保藏地址为中国. 武汉.武汉大学,保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2016086,分类命名为筑波链霉菌HDW68 (streptomyces tsukubansis HDW68)。保藏日期为2016年03月07日。
【附图说明】
[0031] 图1为按中国专利《一种链霉菌及其应用》(CN200810019003.4)实施例6制备得到 的样品的FK520含量HPLC图;
[0032]图2、3、4为以本申请实施例7制备得到的不同样品的FK520含量HPLC图。
【具体实施方式】
[0033]通过下面给出的具体实施例,可以进一步清楚的了解本发明,但他们不是对本发 明的限定。
[0034] 实施例1:保藏号为CCTCC Μ 2016086的菌株的培养特征
[0035]将保藏号为CCTCC Μ 2016086的菌株接种于高氏一号、葡萄糖天门冬素等用于观 察形态特征的培养基。28 °C培养一定的时间5、7、10天,观察并进行描述。
[0036] 保藏号为CCTCC Μ 2016086的菌株在各种培养基上的菌落特征
[0037]
[0038]实施例2:碳源利用及生理生化特征 [0039]生理生化性质采用链霉菌分类中的标准方法。
[0040]保藏号为CCTCC Μ 2016086的菌株的生理生化反应为:在明胶培养基上能液化明 胶,胨化牛奶,不能凝固牛奶,淀粉水解阴性,不利用纤维素,硝酸盐还原阴性。
[0041 ] 利用Biolog(GENIII)自动微生物鉴定系统对菌株streptomyces tsukubaensis进 行了 94种表型测试,包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测:将菌株接种特 定的平板培养基,33°C恒温培养2天,用无菌棉签将平板上的菌体洗下,与接种液(IF-A)混 合,制成菌悬液,用浊度计调整至92%T/IF-A。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog (GENE)微孔的各孔中,每孔100μ1。将微孔鉴定板放在33 °C培养箱中,分别在培养12h、24h、 32h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。
[0042] 经Biolog读数仪分析代谢指纹,筑波链霉菌streptomyces tsukubaensis对3种化 学物质敏感;菌株可较强利用其中17种碳源,对其它54种碳源利用能力较弱或不能利用。菌 株。Biolog系统给出36h鉴定结果。Biolog鉴定结果见表1和表2。
[0043]表1筑波链霉菌对Biolog GENE板上23种化学物质的化学敏感性
[0044]
[0045]说明:+,阳性;-,阴性;B,不确定
[0046] 衷2筑波链霍菌对Biol〇g(GEN ΙΠ)板卜.71种碳源的利用能力
[0047]
[0048]
[0049]
[0050] 说明:+,阳性;-,阴性;B,不确定
[00511实例3:他克莫司的生产发酵培养 [0052]采用CCTCC Μ 2016086的菌株 [0053] 1.摇瓶种子培养
[0054]培养基:可溶性淀粉0.3g,大豆油0.2g,酵母浸出粉0.1 g,玉米粉0 . lg,ΚΗ2Ρ〇4 0.1g,CaC03 0.1g,pH自然,加水至 100ml。
[0055] 接种量:按〇.8ml/瓶的接种量
[0056] 培养:28°C,24h,250rpm
[0057] 在菌丝长起,有明显挂壁现象后,将100ml摇瓶种子培养液接入种子罐中培养。
[0058] 2.种子罐培养
[0059] 培养基:可溶性淀粉1.5kg,大豆油1kg,酵母浸出粉0.5kg,玉米粉0.5kg,KH2PO4 0 · 5kg,CaC03 0 · 5kg,pH 自然,加水至0 · 5吨。
[0060] 装量:1吨发酵罐内装培养基0.5吨,121°C灭菌30min。
[0061 ] 接种量:100ml摇瓶种子。
[0062] 培养:28°C,30h,150rpm
[0063] 3.发酵罐培养
[0064]培养基:土豆淀粉10kg,甘油2.5kg,葵花籽油2.5kg,豆柏粉2kg,生豆粉2kg,肉胨 lkg,亮氨酸lkg,CaC〇3 0.5kg、MgS〇4 0.5kg,加水至0.5吨,调ρΗ8·5。
[0065] 装量:1吨发酵罐内装培养基0.5吨。
[0066]接种量:75L的种子液
[0067] 培养温度:28°C,起始调节罐压0.05MPa,空气流量在1: (0.6±0.2)vvm,搅拌转速 250rpm。代谢过程中当相对溶氧值低于30 %时,先调大空气流量到1: (1 ± 0.2) vvm;当相对 溶氧值再次低于30%时,调大搅拌桨变频值(搅拌桨变频值在(150~250)rpm之间);如果相 对溶氧值再次低于30%,则在(0.05~0.08)MPa范围内增大罐压(发酵过程中罐压维持在 (0.02~0.08)之间)。发酵周期为7天。
[0068] 放罐单位:1323μg/ml
[0069] 实例4:他克莫司的生产发酵培养
[0070] 采用CCTCC Μ 2016086的菌株
[0071 ] 1.摇瓶种子培养
[0072] 培养基:麦芽糖3g,甘油6g,生豆粉3g,大豆蛋白粉1.5g,固体玉米浆6g,CaC03 0.68、恥(:12.48,咖031.58,加水定容至3001111,?!1自然
[0073] 接种量:按lml/瓶的接种量
[0074] 培养:26°C,30h,250rpm
[0075] 在菌丝长起,有明显挂壁现象后,将300ml摇瓶种子培养液接入种子罐中培养。
[0076] 2.种子罐培养
[0077] 培养基:麦芽糖10kg,甘油20kg,生豆粉10kg,大豆蛋白粉5kg,固体玉米浆20kg, CaC03 2kg、NaCl 8kg,KN03 5kg,加水定容至 1 吨,pH自然。
[0078] 装量:4吨发酵罐内装培养基1吨,121°C灭菌30min。
[0079] 接种量:300ml摇瓶种子。
[0080] 培养:26°C,27h,200rpm
[0081 ] 3.发酵罐培养
[0082]培养基:可溶性淀粉150kg,菜油25kg,甘露醇75kg,玉米蛋白粉50kg,酵母浸出膏 75kg,热黄豆粉12.5kg,尿素12.5kg,L-异亮氨酸12.5kg,谷氨酸12.5kg,L-缴氨酸12.5kg, KH2PO4 12.5kg,KN03 12.5kg,CaC03 12.5kg,加水定容至 2.5 吨,调 ρΗ8·8〇
[0083] 装量:4吨发酵罐内装培养基2.5t,121°C灭菌30min。
[0084] 接种量:250L的种子液
[0085] 培养温度:27°C,起始调节罐压0.05MPa,空气流量在l:(0.6±0.2)vvm,搅拌转速 200rpm。代谢过程中当相对溶氧值低于30 %时,先调大空气流量到1: (1 ± 0.2) vvm;当相对 溶氧值再次低于30 %时,调大搅拌桨变频值(搅拌桨变频值在(150~250 )rpm之间);如果相 对溶氧值再次低于30%,则在(0.05~0.08)MPa范围内增大罐压(发酵过程中罐压维持在 (0.02~0.08)之间)。发酵周期为7天。
[0086] 发酵液放罐单位:1288μg/ml。
[0087]实例5:他克莫司的生产发酵培养
[0088]采用CCTCC Μ 2016086的菌株 [0089] 1.摇瓶种子培养
[0090] 培养基:葡萄糖20g,蔗糖20g,啤酒酵母粉10g,豆柏粉30g,MgS〇4 5g,KCl 10g, CaC〇3 5g,pH自然,加水定容至1000ml,分装10瓶。
[0091] 接种量:按]_mi/瓶的接种量
[0092] 培养:3(TC,22h,250rpm
[0093] 在菌丝长起,有明显挂壁现象后,将1000ml摇瓶种子培养液接入种子罐中培养。
[0094] 2.种子罐培养
[0095] 培养基:葡萄糖40kg,蔗糖40kg,啤酒酵母粉20kg,豆柏粉60kg,MgS〇4 10g,KC1 20g,CaC03 lOg,泡敌2kg,pH自然,加水定容至2吨。
[0096] 装量:4吨发酵罐内装培养基2吨,121°C灭菌30min。
[0097] 接种量:1000ml摇瓶种子。
[0098] 培养:3(TC,22h,200rpm
[0099] 3.发酵罐培养
[0100]培养基:蔗糖125kg,葡萄糖25kg,麦芽糖150kg,鱼胨25kg,棉籽饼粉75kg,酵母浸 出粉50kg,蚕蛹粉50kg,谷氨酸25kg,L-组氨酸25kg,ZnS〇4 15kg,KCl 25kg,CaC03 10kg,加 水定容至2.5t,调pH9.0
[0101] 装量:4吨发酵罐内装培养基2.5吨
[0102] 接种量:375L的种子液
[0103] 培养温度:29°C,起始调节罐压0.05MPa,空气流量在1: (0.6 ± 0.2) vvm,搅拌转速 150rpm。代谢过程中当相对溶氧值低于30 %时,先调大空气流量到1: (1 ± 0.2) vvm;当相对 溶氧值再次低于30%时,调大搅拌桨变频值(搅拌桨变频值在(150~250)rpm之间);如果相 对溶氧值再次低于30%,则在(0.05~0.08)MPa范围内增大罐压(发酵过程中罐压维持在 (0.02~0.08)之间)。发酵周期为6天。
[0104] 发酵液放罐单位:1363μg/ml。
[0105]实例6:他克莫司的生产发酵培养
[0106] 采用CCTCC Μ 2016086的菌株
[0107] 1.摇瓶种子培养
[0108] 培养基:甘油6g,玉米淀粉9g,啤酒酵母粉1 · 2g,硫酸铵1 · 8g,K2HP〇43g,CaC〇3 3g, pH自然,加水定容至600ml,分装6瓶。
[0109] 接种量:按1.2ml/瓶的接种量
[0110] 培养:29°C,28h,250rpm
[0111] 在菌丝长起,有明显挂壁现象后,将600ml摇瓶种子培养液接入种子罐中培养。
[0112] 2.种子罐培养
[0113] 培养基:甘油15kg,玉米淀粉22.5k
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