一种油菜转基因成分的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种油菜转基因成分的检测方法。
【背景技术】
[0002] 油菜是我国主要作物，油菜转基因技术与产品均已成熟，需要对转基因油菜的推 广进行监管，转基因成分检测是转基因监管的技术支撑。
[0003] 现有的转基因成分检测技术主要检测核酸或蛋白质，其中，基于核酸的检测方法 主要流程为：提取待测样品中的核酸，利用PCR(PolymeraseChainReact ion，聚合酶链反 应)的方法扩增样品中的转基因成分，利用实时定量、琼脂糖电泳或芯片技术检测转基因成 分是否存在。
[0004] 在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题中的一种：
[0005] 转基因成分多种多样，而现有技术一次只能检测其中一种或少数几种，因此，需要 对可能的多种转基因成份逐一进行检测，才能确定为"非转基因"产品；一般检测的是共转 化的转基因成分，而不是外源基因本身，因此，对于无标记转基因来说，采用现有的检测方 法进行检测会失效;检测基本上是定性检测，但定量检测又有其现实需求，例如，相邻田块 的转基因油菜品种的少量花粉被传到了非转基因品种上，在定性检测时，非转基因品种将 被误判为转基因品种。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种油菜转基因成分的检测方 法。所述技术方案如下：
[0007] 本发明实施例提供了一种油菜转基因成分的检测方法，所述方法包括：
[0008] 确定待测样品中需要检测的转基因成分、所述待测样品中的内源标准基因和所述 待测样品的外源标准基因，所述待测样品为油菜植株或所述油菜植株的一部分；
[0009] 制备用于扩增所述转基因成分、所述内源标准基因和所述外源标准基因的测试区 域的多重扩增引物；
[0010] 对所述待测样品进行抽样并混合，得到混合样品；
[0011] 提取所述混合样品的基因组；
[0012] 向所述混合样品的基因组中加入所述外源标准基因，得到混合核酸；
[0013] 利用所述多重扩增引物对所述混合核酸进行扩增，得到扩增产物，利用所述扩增 产物构建高通量测序文库；
[0014] 对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；
[0015] 分析所述测序片段组，获得所述待测样品中所述转基因成分的测序片段的数量、 所述内源标准基因的测序片段的数量和所述外源标准基因的测序片段的数量；
[0016] 根据所述外源标准基因的测序片段的数量，判断实验是否成功；
[0017] 若所述实验成功，则计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量；
[0018] 根据所述转基因成分的含量判断所述待测样品中是否含有转基因成分。
[0019] 具体地，所述转基因成分为外源功能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源 插入旁侧序列中的至少一种。
[0020] 具体地，所述内源标准基因为所述待测样品的基因组中的单拷贝基因。
[0021 ]具体地，所述外源标准基因不存在于所有生物中。
[0022] 具体地，所述判断实验是否成功的方法为：当所述外源标准基因的测序片段的数 量和所述内源标准基因的测序片段的数量均2 α?时，则实验成功；当所述外源标准基因的 测序片段的数量或所述内源标准基因的测序片段的数量〈α?时，则实验失败;其中，α?为判 定阈值。
[0023] 具体地，所述判定所述待测样品是否含有转基因成分的方法为：当需要检测的任 意一种所述转基因成分的含量2 α2时，判定所述待测样品含有转基因成分；当所有所述转 基因成分的含量<α2时，判定所述待测样品不含有转基因成分;其中，α2为判定阈值。
[0024] 具体地，计算所述待测样品种中所述转基因成分的含量的方法为:第m种所述转基 因成分的含量的计算公式为
其中，i为所述第m种转基因成分的 第i个测试区域，nl为所述第m种转基因成分的所述测试区域的个数，bi为所述第m种转基因 成分的第i个所述测试区域的所述测序片段的数量，k为第k种所述内源标准基因，n3为所述 内源标准基因的个数，j为第k种所述内源标准基因的第j个测试区域，n2为所述第k种内源 标准基因的所述测试区域的个数，aj为所述第k种内源标准基因的第j种所述测试区域的所 述测序片段的数量;N为所有所述内源标准基因的所述测试区域的总数。
[0025 ]具体地，所述外源标准基因的质量与所述混合样品的基因组的总质量的比例大于 1/100000。
[0026] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是:本发明提供的检测方法可以在 不同待测样品、不同检测的目标基因间通用，可以一次性检测任意多种需要检测的转基因 成分，从而判定待测样品是否含有转基因成分，该方法可以实现定量检测，且检测结果几乎 没有下限，结果准确可靠，是现有技术达不到的。
【具体实施方式】
[0027] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一 步地详细描述。本发明实施例中未注明或详细描述的操作流程或操作规范均为普通分子生 物学技术人员所熟知的操作。本发明实施例中未注明的试剂或生物材料均为市场上销售的 常用试剂或生物材料，均为普通分子生物学技术人员所熟知的，且可以在市场上购买到。 [0028] 实施例
[0029] 通过农杆菌介导法将双丙氨酰磷抗性(Biolaphos resistance，Bar)基因导入贵 油恢15油菜品种，自交纯化3代后，获得改造的贵油恢15油菜品种种子，作为本实施例的待 测油菜品种。其中，贵油恢15油菜是转基因油菜受体品种，由贵州农学院油菜研究室育成， 本实施例中使用的贵油恢15油菜种子由江汉大学保存和繁殖。
[0030] 油菜植物品种转基因成分检测方法，具体步骤如下：
[0031] 步骤1、确定待测样品中需要检测的转基因成分、待测样品中的内源标准基因和待 测样品的外源标准基因，具体方法如下:待测样品为油菜植株或油菜植株的一部分，其中， 油菜植株可以为油菜植株的根、茎、叶、花、果实和种子等器官，也可以是2种及2种以上的不 同器官的混合物，如叶和茎的混合物，油菜植株的一部分可以为油菜植株的根、茎、叶、花、 果实和种子等至少一个器官中的一部分。在本实施例中，待测样品为改造后的贵油恢15油 菜的种子，转基因成分、内源标准基因和外源标准基因均2 1个，转基因成分可以为外源功 能基因、抗性标记基因、启动子、终止子和外源插入旁侧序列中的至少一种，即通过转基因 技术手段向贵油恢15油菜品种中转入不存在于贵油恢15油菜品种中的外源核酸序列；内源 标准基因为待测样品的基因组中的单拷贝基因。在本实施例中，内源标准基因通过NCBI (http://www.ncbi .nlm.nih.gov/)在待测样品基因组上比对时为单一序列；外源标准基因 不存在于所有生物中，在本实施例中，所使用的外源标准基因为ERCC04基因，其在NCBI上同 源比对时，未发现同源序列，可以判定外源标准基因不存在于所有生物中。在本实施例中， 检测的转基因成分共5种，内源标准基因1种，外源标准基因1种，其相关信息见表1，表1中所 列转基因成分不仅包括Bar基因，Bar基因为外源功能基因，还包括其他转基因成分，这些转 基因成分在转基因作物中广泛使用，因此，本实施例提供的检测方法具有通用性。表1中的 基因序列有两种表不方式，一种是直接与出基因序列，另一种是NBCI的基因编号，表1中的 测序区域中的数字代表碱基的位置，该基因的第1个碱基的位置定义为1。
[0032] 表1为实施例一中被检测基因的相关信息与检测结果
[0033]
[0034]
[0035] 表1中"/"表示无。
[0036] 步骤2、制备用于扩增转基因成分、内源标准基因和外源标准基因的多重扩增引 物，具体方法如下：
[0037] 多重扩增引物的获取过程如下：登录赛默飞世尔公司多重PCR引物在线设计网页 https ://ampl iseq · com/